分享一篇最近发表在 Science 上的文章，本文的题目是“Ribozyme-activated mRNA trans-ligation enables large gene delivery to treat muscular dystrophies”。本文的核心是作者们利用 RNA 核酶在哺乳动物细胞中实现了大片段基因的表达。本文的通讯作者是 University of Rochester 的 Douglas M. Anderson。
具有自催化功能的 RNA 序列广泛地存在于自然界中，它们与很多生物学过程相关，比如内含子剪接、病毒基因组的滚环复制和肽键的形成。对于原核生物和真核生物而言，绝大部分的细胞质 RNA 是通过 5’-磷酸和 3’-羟基连接的，但是对于 pre-transfer RNA 和编码内质网应激响应蛋白 XBP1 的 mRNA，它们会被特殊的核酸内切酶切除一个 5’-羟基和 3’-磷酸或 2’,3’-环磷酸，随后细胞中的 RtcB 负责将 RNA 的 5’-羟基和 2’,3’-环磷酸连接起来，这一过程叫做 cis-splicing。
核酶 Ribozyme 切割 RNA 后则会形成 5’-羟基和 2’,3’-环磷酸，作者想到如果将一个基因分成两半，克隆在不同的载体上，每一半都融合一个核酶，即第一个载体上的核酶在基因 N 端的片段后，另一个载体上的核酶在基因 C 端的片段前，这样 N 端的 mRNA 就会被切出 2’,3’-环磷酸， N 端的 mRNA 则会被切出 5’-羟基。随后，两个 RNA 则会被细胞内的 RtcB 连接酶整合成一个完整的 mRNA，作者将该技术命名为 StitchR。
本文作者们对 StitchR 进行了彻底的优化，比如优化核酶和增加 intron 等。
该技术的优势在于，核酸包装的大小是限制 AAV 应用的关键，它只能包装小于 4.7 kb 大小的 DNA。因此，AAV 无法递送大片段基因，但是借助 StitchR 就可以把大片段切成两个可以被 AAV 装下的小片段，在细胞内重新“缝”成一个完整的 mRNA。本文举了三个有趣的应用，分别拼成了 6240 bp Dysferlin，～7 kb delta_H2-R15 Dystrophin 和一套 PEmax 系统。值得注意的是，作者发现，StitchR 缝合后的 mRNA，其蛋白表达的水平与几乎内源相当。总之，该技术非常具有应用前景。
本文作者：LZH
责任编辑：ZF
原文链接：https://doi.org/10.1126/science.adp8179
DOI: 10.1126/science.adp8179
