分享一篇发表在Nature上的文章，题目为“Engineering a genomically recoded organism with one stop codon”，通讯作者共两位，分别是来自耶鲁大学的Farren J. Isaacs教授和Jesse Rinehart教授。Rinehart课题组主要从事磷酸化修饰方向的研究，Isaacs课题组的研究方向为细胞工程与定向进化。

在天然系统中，基因翻译依赖三联密码子决定蛋白质的氨基酸序列，其中TAG、TGA和TAA是标准的终止信号。这些终止密码子虽然功能相同，但它们的并存仅仅是进化冗余的产物。在本文中，研究人员通过合成生物学手段，将所有终止密码子压缩至UAA，释放了UAG和UGA的氨基酸编码能力，从而将其用于高效整合非标准氨基酸（non-standard amino acids）。

为了实现这一目标，研究人员采用了多重自动基因组工程（MAGE）技术，这是一种基于寡核苷酸定向突变的精确基因编辑方法。通过设计一系列短寡核苷酸，携带TGA→TAA的突变信息，并将其导入大肠杆菌C321.ΔA菌株，利用宿主的错配修复系统进行同源重组，逐步完成TGA的替换。这一过程被循环多次，最终完成了1195个TGA密码子的全基因组替换。

在解决了TGA密码子的替换问题后，研究人员还面临释放因子2（RF2）的挑战。RF2能够识别UGA并终止翻译，这可能会干扰UGA作为密码子的重新编码。为了解决这一问题，研究团队对RF2进行了精准工程化改造，引入了S205P和E170K突变，显著降低了RF2对UGA的亲和力，从而为UGA的重新编码创造了条件。

此外，研究人员还发现天然大肠杆菌的tRNATRP具有一定的摇摆效应，能够错误地识别UGA并在UGA密码子位置插入色氨酸。为了解决这一问题，研究人员在tRNATRP上引入了A37G突变，破坏了i6A37修饰，使tRNATRP不再错误识别UGA，从而确保了UGA可以作为一个真正独立的密码子用于非标准氨基酸的整合。

在解决了密码子误读和释放因子干扰的问题后，研究团队构建了一套正交翻译系统，为UAG和UGA分别设计了特定的氨酰-tRNA合成酶，UAG重新编码为对乙酰苯丙氨酸（pAcF），UGA重新编码为Boc-赖氨酸（BocK）。经过优化的菌株在UAG+UGA双非标准氨基酸整合方面的效率提高了20倍，蛋白的翻译准确率达到99%以上。

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这一研究成果不仅推动了对遗传密码可塑性的理解，也为生物制造和合成生物学开辟了新的可能性。新型菌株展现出卓越的生物安全性，由于不再使用TAG和TGA作为终止密码子，病毒无法通过常规的翻译机制劫持宿主细胞来复制自身。噬菌体感染实验验证了这一点，新型菌株对含TAG的λ噬菌体完全抵抗，并显著降低了含TGA的μ噬菌体感染率。

本文作者：TZS

责任编辑：WYQ

DOI：10.1038/s41586-024-08501-x

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08501-x