推荐一篇发表在Nature Methods上的文章，题目为“Proteome-scale tagging and functional screening in mammalian cells by ORFtag”，通讯作者是四位来自澳大利亚维也纳大学的科学家，第一位是Julius Brennecke ，研究方向为真核生物基因组和RNA通路；第二位是Ulrich Elling，研究方向为基因组和测序；第三位为Alexander Stark ，研究方向为转录组测序；第四位为Stefan L. Ameres ，研究方向为转录组对基因表达的影响。
对蛋白质功能的研究十分重要，目前对蛋白质功能研究的途径主要有两种，一种是基于基因丧失或敲除，例如CRISPR-Cas9和CRISPRi，但往往受到敲除致死或者一些回补机制的影响，另一种是提高蛋白质表达的丰度进行鉴定，依赖于开放阅读框(open reading frame, ORF)文库(ORFeomes)的传递和表达，不仅成本高且难以维护，而且由于DNA合成、克隆、病毒包装和传递到细胞中的限制，往往只能在较短的ORF中实现 (<5 kb)。因此，在这篇文章中，作者开发了一种可以在蛋白质组的规模上进行平行标记和蛋白质功能筛选的方法，名为ORFtag。这种方法能够对各种转录调节因子进行鉴定，作者成功鉴定出了一些已知的调节因子，并发现了一种新的调节因子Zfp574。
ORFtag是基于插入元件，也就是逆转录病毒载体构建的，其中包含一个活性启动子(Pstrong)、一个选择基因(NeoR)和一个功能标签，以及一个剪接供体序列。在对细胞进行大规模转染后，ORFtag会随机整合到基因组中，并将功能标签剪接到整合位点下游的剪接受体位点，驱动附近内源基因位点的转录，最终产生N端融合蛋白。在此基础上，对转染成功的细胞的功能标签进行筛选，在分选得到的的细胞群中，使用反向PCR (iPCR)绘制整合位点，然后进行大规模测序，并通过评估选定样本和背景样本之间每个基因插入的富集程度，来鉴定标记基因。
为了对这种方法进行测试，作者对小鼠胚胎干细胞中的转录激活因子、转录抑制因子和转录后基因调控因子进行了功能筛选。作者将候选蛋白质与细菌四环素阻遏蛋白(TetR)的DNA结合域融合，使其能够被招募到整合的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因上游的TetO结合位点。然后进行荧光分选，筛选出GFP表达增加的细胞，再通过测序，鉴定出哪些基因被插入的丰度上升，这些基因则可能是潜在的转录激活因子。作者通过类似的方法筛选了转录抑制因子和转录后基因调控因子，并一共鉴定到了139个潜在的转录激活因子，207个抑制因子和77个PTGR蛋白。作者分别从三种筛选中各挑选了8个靶点进行验证，克隆和转染每个靶点并融合到各自的TetR或λN标签，测试这是否足以调节各自的报告基因，所有测试的候选靶点，包括之前未与各自的生物过程相关联的靶点，都可以得到阳性的验证，证明ORFtag筛选具有高度特异性和低假阳性率。作者重点研究了未被表征过为转录激活因子的的锌指蛋白Zfp574的内源性功能，通过快速耗竭发现Zfp574的缺失会导致显著的生长缺陷，并通过Cut&Run技术在全基因组范围内鉴定了Zfp547的140个结合位点，其中大多数(87.9%)位于启动子近端位置。
总之，作者开发了一种新的方法ORFtag，为蛋白质功能的大规模筛选提供了一个新的方案。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02339-x
文章引用：10.1038/s41592-024-02339-x
