分享一篇发表在Nature Methods上的文章，题目为“Multiplexed profiling of intracellular protein abundance, activity, interactions and druggability with LABEL-seq”，通讯作者是来自美国华盛顿大学的两位科学家，一位是Douglas M. Fowler，主要进行DNA序列与蛋白质表型关系的研究，另一位是Dustin J. Maly，主要进行信号转导的化学生物学研究。
蛋白质的序列决定其性质和功能，而蛋白质序列的突变则会带来蛋白质结构、功能、成药性、相互作用等多种性质的改变。然而，目前已有的进行蛋白质突变体大规模研究的方法，通常只能间接表征蛋白质突变带来的某一个效应，而不能同时评估其他的效应。因此，本文开发了一种新型的蛋白质突变体研究方法，LABEL-seq，可以在活细胞中直接表征蛋白质突变所导致的丰度、活性、相互作用和成药性等多种蛋白质性质的改变。
LABEL-seq技术的核心在于在活细胞中将感兴趣蛋白的突变体与可以与RNA结合的蛋白结构域（RNA-binding domain, RBD）融合，并同时表达可以与RBD结合的与蛋白突变体相对应的单个RNA条形码（barcode），使其与RBD稳定结合，在后续的研究流程中，只需要对barcode进行富集和大规模测序鉴定，就可以表征该蛋白的丰度、活性等性质。作者选用了一种多结构域激酶Braf作为模式蛋白，Braf 在致癌信号传导中起核心作用，已经有超过250种突变在体细胞中被鉴定到，因此对于其突变效应的大规模鉴定至关重要。
作者首先对于RBD结合的RNA barcode结构进行了设计和优化，为了增加RNA barcode在富集和生化实验中的稳定性，作者选择了一种环状的circRNA的结构，其中包含可以与MS2外壳蛋白（MS2 coat protein, MCP）的RBD结合的MS2茎环，以及含有16个核苷酸的barcode部分。为了保证MCP融合的蛋白突变体与其对应的RNA barcode被同时且唯一地转染到某一个活细胞内，作者构建了在基因组中含有单个Bxb1重组位点的HEK293T细胞系，该重组位点的两侧分别是Tet诱导启动子和U6启动子，从而将整合限制在一个含有蛋白质变体和MS2-circRNA条形码序列对的单个转基因盒中，并保证他们只在重组后表达。
在验证了RNA barcode与蛋白质突变体结合的稳定性和唯一性之后，作者构建了含有1600+个蛋白质突变体的Flag-tdMCP融合的Braf突变体-RNA barcode的文库，首先验证了该平台鉴定不同条件下蛋白质突变体丰度的能力。作者将Flag-tdMCP 标记的蛋白质变体与Myc-tdMCP标准品共表达，用标准品作为MS2-circRNA的细胞内竞争物，然后进行平行的Flag和Myc免疫沉淀实验进行barcode富集，最终获得与蛋白质变体或标准品结合的barcode序列频率比，由此获得不依赖于MS2-circRNA和蛋白质变体的相对细胞内表达水平的蛋白丰度读数（直接检测某种感兴趣的条件处理下蛋白丰度的变化，而不受到本身表达水平的影响），并以WB为标准证明了barcode测序可以获得可信的蛋白丰度结果。
随后，作者进行了蛋白质活性的分析。与丰度测试不同的是，作者将tdMCP与Braf的蛋白底物融合表达构建了Flag-tdMCP-Erk2，再对磷酸化的底物进行免疫沉淀，就可以用barcode表征不同突变体蛋白进行底物磷酸化的活性水平。作者计算了磷酸化Erk2免疫沉淀获得的barcode与Flag免疫沉淀获得的barcode的比例（后者代表所有的Erk2），作为不依赖蛋白表达水平的蛋白活性读数。
接下来作者进行了蛋白质相互作用的测试。作者将TurboID与Braf的相互作用蛋白（如Craf和Mek1）融合表达，这样蛋白质突变体与该蛋白发生相互作用后，TurboID就可以对tdMCP标记的蛋白质突变体进行细胞内生物素标记，再用链霉亲和素进行富集，就可以表征蛋白质突变体与该蛋白发生相互作用的水平。
最后，作者对LABEL-seq获得的几种Braf突变体的生化特性（丰度、活性、与下游蛋白质的相互作用水平等）进行了聚类分析，并利用收集的数据进行了逻辑回归模型的训练，以此来预测蛋白质突变对细胞表型造成的影响以及突变体对PROTAC药物降解的敏感性。
总之，作者构建了一个以LABLE-seq为基础的蛋白质突变体研究平台，可以对蛋白质的丰度、活性和相互作用水平进行多重研究，并进行细胞表型和蛋白成药性的预测。
https://www.nature.com/articles/s41592-024-02456-7
原文引用：DOI：10.1038/s41587-024-02432-8
