分享一篇发表在Nature Metabolism上的文章：Regulation of urea cycle by reversible high-stoichiometry lysine succinylation，通讯作者是UCSF的Eric Verdin教授和巴克老龄化研究所的Birgit Schilling教授，前者课题组主要研究衰老与免疫系统的关系，后者课题组主要通过质谱技术研究衰老过程的分子机制。这篇文章作者通过分析鼠肝中琥珀酰化修饰率，找到了高修饰率的ASS1蛋白，并对其功能展开了研究。
赖氨酸上的琥珀酰化修饰已经被报道参与调控多种细胞代谢过程，目前通过抗体富集结合蛋白质谱的方式已经能够在细胞内鉴定到数千个琥珀酰化修饰的位点，但如何从大量的修饰位点中找到起重要生物学功能的位点将是很大的挑战。本文作者希望能够通过全局性地鉴定细胞内各个蛋白上的琥珀酰化修饰率，从而从中寻找具有重要功能的高修饰率的琥珀酰化修饰位点。
作者首先改进了琥珀酰化修饰质谱样品的制备流程，由于琥珀酰化修饰后的赖氨酸无法被常用的Trypsin酶切割，会产生长度更长的修饰肽段，因此作者采用GluC酶切的方式，发现在抗体富集后能够鉴定到与Trypsin数目相当的修饰位点，且GluC酶切鉴定到了大量全新的琥珀酰化修饰位点（673个）。随后为了对琥珀酰化修饰率进行定量，作者对SIRT5 (琥珀酰化去修饰酶) WT/KO的鼠肝进行裂解，再用重标的d4-琥珀酸酐给蛋白全部引入重标的琥珀酰化修饰，经过GluC酶切后用SWATH-DIA进行检测，最后通过轻标和重标的琥珀酰化修饰肽的比值来确定修饰率。
作者通过这种方法鉴定到了822个琥珀酰化修饰位点，进一步筛选出了238个在抗体富集结果中也被鉴定到的位点，对这些修饰位点的修饰率进行分析后发现大多数位点修饰率都在0.1%-5%之间，有41个位点表现出>5%的修饰率。进一步分析这些琥珀酰化修饰位点在SIRT5敲除后的修饰水平变化后作者发现，ASS1蛋白的K112和K121在SIRT5敲除后有最大幅度的琥珀酰化修饰水平上升，分别从2.3%, 18.1%上升到了39.9%, 39.6%，因此后续作者对ASS1上琥珀酰化修饰的功能展开了研究。
通过分析蛋白结构作者发现，只有K121位在ASS1蛋白的活性口袋周围，序列分析表明K112位在物种间并不保守，且只有K121E的突变体蛋白会导致ASS1的热稳定性和酶活显著下降，K112E的突变则基本无影响，说明K121位更可能是功能性的琥珀酰化修饰位点。ASS1作为精氨酸琥珀酸合成酶参与了细胞内的尿素循环，作者通过代谢组学发现，敲除了SIRT5后的小鼠肝脏中尿素循环相关的代谢物水平明显下降，说明SIRT5敲除后细胞内ASS1活性的确降低了。同时作者发现，SIRT5的敲除导致了小鼠对氨的解毒能力下降，而在小鼠肝脏中对ASS1进行过表达则可以降低由于SIRT5敲低带来的氨水平上升，对应的K121E突变体则不具有这种效果，说明ASS1的K121位对于氨解毒过程起关键作用。
总之，这篇文章通过重标琥珀酸酐标记结合SWATH-DIA技术鉴定了鼠肝中琥珀酰化的修饰率，并从中找到了高修饰率蛋白ASS1，对ASS1的K121位琥珀酰化修饰调控尿素循环并参与氨解毒的功能进行了研究。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s42255-024-01005-y
文章引用：10.1038/s42255-024-01005-y
