Nat. Chem. Bio .| 用于即时和靶向特异性蛋白降解的dTAG系统

分享一篇发表在Nat Chem Bio上的文章，文章题目“The dTAG system for immediate and target specific protein degradation”，通讯作者是Nathanael S. Gray 和 James E. Bradner ，他们的研究方向主要集中在癌症生物学和化学生物学领域，特别是利用小分子化合物调节基因产物丰度的机制，如 RNA 干扰和 CRISPR-Cas9 基因编辑。他们致力于开发和应用新型化学生物学工具，如 dTAG 系统，来实现目标蛋白质的快速、特异性降解，以研究蛋白质功能和进行早期药物靶标验证。此外，他们的工作还涉及了解这些蛋白质降解技术在疾病生物学中的作用，特别是在癌症治疗中的应用。Gray 专注于癌症生物学，特别是转录调控和表观遗传学，而 Bradner 则专注于发现和开发针对表观遗传靶标的小分子，用于治疗癌症和其他疾病。

背景：

这篇文献主要讲述了一种新的化学生物学系统，称为dTAG系统，用于快速且特异性地降解目标蛋白质。作者意识到传统的基因沉默技术如RNA干扰和CRISPR-Cas9基因编辑在研究基因功能丧失或获得时存在局限性，特别是在评估细胞生长和存活所需蛋白质的急性变化时。此外，虽然小分子化合物干扰可以快速评估生物反应，但它们通常受限于选择性化学物质的创建时间、对特定蛋白质结构域功能的干扰，以及潜在的非靶向效应。为了克服这些限制，作者着手创建一个混合化学生物学系统，该系统结合了小分子的快速实验优势和遗传学的精确性，可以快速降解特定等位基因的蛋白质嵌合体，用于生物学研究和早期目标验证。他们通过结合FKBP12^F36V的选择性配体和CRBN的异双功能降解剂，实现了目标蛋白质的快速降解，并利用这种策略研究了蛋白质丢失的即时效应，如KRAS^G12V对蛋白质组信号传导的即时效应，以及在体内的快速降解。这项技术平台将为生物学研究提供动力学分辨率，并在药物发现的背景下提供目标验证。

关键数据：

1、dTAG分子参与FKBP12^F36V和CRBN

作者首先介绍了dTAG分子如何与FKBP12^F36V和CRBN相互作用，从而实现目标蛋白质的降解。作者设计了一系列dTAG分子，这些分子能够选择性地与经过工程改造的FKBP12蛋白（FKBP12^F36V）结合，并通过连接的CRBN配体招募CRBN E3泛素连接酶。这种结合诱导FKBP12F36V和CRBN形成复合体，导致目标蛋白的泛素化和随后通过蛋白酶体途径的降解。作者通过生化实验验证了dTAG分子的特异性和效果，发现某些dTAG分子（如dTAG-7和dTAG-13）能够选择性地与FKBP12^F36V和CRBN结合，而对野生型FKBP12蛋白的亲和力较低。此外，他们还开发了基于荧光的邻近测定（AlphaScreen）来评估这些分子的结合选择性和诱导异二聚体形成的能力。

图1 在生化分析中，异双功能dTAG分子参与并二聚FKBP12^F36V和CRBN

2、通过dTAG-7和dTAG-13降解细胞靶点

作者利用一种改良的双荧光素酶报告基因系统来评估FKBP12^WT和FKBP12^F36V融合蛋白在细胞内的降解情况。实验结果显示，dTAG-7和dTAG-13能够选择性地降低FKBP12^F36V融合蛋白的荧光素酶信号，而对FKBP12^WT融合蛋白的影响较小。此外，这些分子在CRBN缺失的细胞中没有活性，表明它们的功能依赖于CRBN。研究还发现dTAG-7和dTAG-13能够快速诱导FKBP12^F36V融合蛋白的降解，并且这种降解需要蛋白酶体和CRBN的活性。这些结果证实了dTAG分子可以在细胞内实现快速且选择性的CRBN介导的目标蛋白降解。

图2 dTAG-7和dTAG-13以CRBN依赖的方式选择性降解FKBP12^F36V

3、通过CRISPR介导的FKBP12^F36V敲入降解BRD4

这部分主要讲述了通过CRISPR介导的FKBP12^F36V敲入实现BRD4的特异性降解。作者首先验证了在体外表达的FKBP12^F36V-BRD4融合蛋白可以被dTAG分子有效降解。然后，他们利用CRISPR-Cas9系统在BRD4基因位点敲入FKBP12^F36V标签，创建了能够在药物诱导下特异性降解内源性BRD4蛋白的细胞系。通过这种方法，能够在细胞中实现对单一BET家族蛋白BRD4的控制，独立于其他BET蛋白（如BRD2和BRD3），进而研究BRD4在基因表达调控中的作用。实验结果表明，使用dTAG-13处理这些敲入细胞可以迅速且特异性地降解BRD4融合蛋白，而不影响其他BET蛋白的表达，证实了dTAG系统在研究蛋白质功能和调控中的潜力。

图3 内源性标记的BRD4的选择性药理降解

4、dTAG对研究分化蛋白的普遍性

作者利用N-和C-末端的慢病毒表达系统来评估CRBN介导的多种靶蛋白的药理学降解，包括FKBP12^F36V-KRAS^G12V和FKBP12^F36V-EZH2等。他们证实了这些融合蛋白在MV4;11细胞中表达后，可以通过dTAG-7或dTAG-13处理被有效降解。此外，研究者们还探讨了KRAS^G12V缺失对细胞信号传导的即时效应，发现FKBP12^F36V-KRAS^G12V的降解可以迅速降低pMEK和pAKT的水平，并且这种降解是可逆的。通过质谱和磷酸化蛋白质组学分析，研究者们展示了FKBP12^F36V-KRAS^G12V降解后细胞信号传导程序的快速逆转。这证明了dTAG系统在研究蛋白质功能和信号传导变化中的广泛适用性。

图4 FKBP12F36V融合嵌合体的快速降解

5、KRAS^G12V缺失对细胞信号传导的直接影响

作者利用dTAG系统降解FKBP12^F36V-KRAS^G12V融合蛋白，并观察到这种降解迅速降低了pMEK和pAKT的水平，导致细胞形态和生长特性发生显著变化。通过多路复用质谱和磷酸化蛋白质组学分析，他们发现KRAS^G12V的降解导致ERK信号通路依赖的蛋白质包括Jun、Myc和Palld等的磷酸化水平显著降低，从而证实了KRAS^G12V融合蛋白的功能性。此外，RNA测序分析显示，KRAS^G12V的降解可以迅速逆转由KRAS^G12V引起的转录变化，恢复到与对照细胞相似的基础转录状态。这些结果表明，dTAG系统可以用于研究蛋白质降解对细胞信号传导和转录调控的快速影响。

作者发现，FKBP12^F36V-KRAS^G12V融合蛋白的降解导致了一系列与ERK信号通路相关的基因表达的快速变化。通过RNA测序，他们观察到在FKBP12^F36V-KRAS^G12V降解后，之前由KRAS^G12V诱导表达的基因迅速恢复到接近NIH/3T3对照细胞的水平，表明KRAS^G12V的缺失可以迅速影响基因表达。此外，基因集富集分析（GSEA）和Ingenuity Pathway Analysis进一步证实了KRAS^G12V降解后细胞信号传导的快速变化，这些变化主要是通过ERK信号通路介导的。这表明KRAS^G12V蛋白的降解不仅影响蛋白质层面的信号传导，而且还能迅速改变细胞的转录调控状态。

图5 KRAS^G12V的降解迅速逆转转化细胞的蛋白质组和转录信号程序

6、在体内快速而有效的降解

作者利用稳定表达FKBP12^F36V-luciferase（luc-FKBP12^F36V）嵌合体的人类白血病细胞系MV4;11，通过非侵入性生物发光测量来监测给予dTAG分子后的蛋白质降解效果。在体外实验中，dTAG-13处理导致luc-FKBP12^F36V的生物发光信号有效减弱。基于这些有力的体外结果和dTAG-13的有利药代动力学参数，作者进一步在体内评估了dTAG-13。在小鼠模型中，给予dTAG-13后，观察到生物发光信号显著、快速且持久地降低，表明luc-FKBP12^F36V被有效降解。在最后一次给药后28小时，观察到生物发光信号恢复到与对照组相似的水平，表明蛋白质降解是可逆的。

图6 在体内进行快速和可逆降解的评价

总结：

这篇文献主要讲述了dTAG系统，一种新型的化学生物学工具，它能够实现目标蛋白质的快速和特异性降解。作者设计了能够与FKBP12^F36V和CRBN结合的dTAG分子，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在BRD4基因位点敲入FKBP12^F36V标签，实现了BRD4蛋白的特异性降解。他们还展示了dTAG系统在降解多种不同蛋白质中的普适性，包括KRAS^G12V，并研究了KRAS^G12V缺失对细胞信号传导和转录调控的即时效应。此外，作者在活体动物模型中验证了dTAG系统诱导的蛋白质降解的快速性和有效性。这些发现为研究蛋白质功能和开发新疗法提供了一个强大的工具。

本文作者：BCH

责任编辑：ZWY

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29581585/

原文引用：DOI：10.1038/s41589-018-0021-8