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Nat. Biotechnol. | 利用SCOPE技术对细胞外囊泡mRNA进行扩增突变分析
分享一篇发表在Nature Biotechnology上的文章,文章的题目为“Amplifying mutational profiling of extracellular vesicle mRNA with SCOPE”,本文的通讯作者是来自哈佛医学院的Hakho Lee教授和Cesar M. Castro副教授以及来自成均馆大学的Taejoon Kang副教授,三位教授的研究方向都与疾病的检测有关。
细胞外囊泡(EV)因其携带多种分子货物,成为液体活检的重要分析目标。EV中的mRNA能够反映体细胞的突变,对癌症的发生和发展至关重要。此外,EV还可以保护mRNA免受生物体中核酸酶的影响。因此,检测EV中的mRNA具有显著优势。然而,EV中的RNA大多是非编码RNA,肿瘤来源的EV也只占所有EV中的一小部分,因此对EV中mRNA的检测通常需要大样本量和复杂的技术(如微滴数字PCR和下一代测序技术),这导致其难以用于临床分析。CRISPR技术因其序列特异性可以用于分子诊断,CRISPR相关蛋白在识别靶核酸后成为活性内切酶,可以对报告探针(如带有荧光基团和淬灭剂的单链DNA)进行切割来放大信号。然而,由于EV中mRNA的低丰度,这种策略需要对mRNA进行预扩增,这不可避免的带来扩增中固有的复制错误和偏差。
本文作者提出了一种自扩增和CRISPR辅助的分析EV的平台(SCOPE),通过其双重放大机制实现了单核苷酸特异性高灵敏度的mRNA检测。SCOPE将CRISPR和靶RNA扩增耦合,SCOPE体系同时包含CRISPR体系(Cas13a/crRNA)和靶RNA扩增(T7聚合酶及NTPs)体系,并引入了设计的RNA-DNA杂交的信号模版。信号模板有三部分,分别是Cas13a/crRNA可切割的荧光RNA片段,荧光淬灭剂以及结合T7聚合酶并转录靶RNA的DNA模版。SCOPE的过程首先是Cas13a/crRNA识别靶mRNA,激活CRISPR活性,然后切割信号模板RNA片段导致荧光信号的释放,切割后的信号模板可被T7RNA聚合酶识别启动转录完成靶RNA的扩增,扩增的靶RNA复制体又与Cas13a/crRNA结合实现信号的放大。
作者后续验证了SCOPE确实可以通过耦合CRISPR切割反应和靶RNA扩增反应实现信号的扩增。然后,作者对比了SCOPE和RT-PCR的灵敏度,选择最常突变的癌基因KRAS作为代表验证了其序列特异性。
最后作者还将SCOPE用于小鼠肺癌模型的检测,临床直肠癌患者的检测,以及胶质瘤患者的分层,验证了SCOPE技术的临床应用潜力。以小鼠为例,作者首先用不同细胞系验证可以通过EV中mRNA推断细胞基因型,然后在基因工程肺腺癌模型中检测小鼠血浆中EV的mRNA,发现SCOPE结果与免疫组织化学(IHC)和计算机断层扫描(CT)结果相符合。
总的来说,本文开发了一种可以实现单核苷酸特异性,高灵敏度的EV中mRNA的检测策略。这种策略在临床中的肿瘤检测中具有一定的应用潜力。
原文链接:https://www.nature.com/articles/s41587-024-02426-6
文章引用:10.1038/s41587-024-02426-6
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