JACS | DNA调控的多蛋白互补控制

分享一篇发表在 JACS 杂志上的文章，题目为“DNA-Regulated Multi-Protein Complement Control”。文章的通讯作者是西北大学化学系的 Chad A. Mirkin 教授，致力于利用 DNA 和其他核酸构建纳米尺度结构和器件，发挥其在生物医学、数据分析和能源存储等领域的应用。本文利用 DNA 杂交技术独立控制多蛋白体系中的蛋白结合事件，为开发新型生物体系和调控生物功能提供了新方法。

蛋白质与其互补物/底物之间的相互作用对于生命至关重要，它们调节着包括结构维持、分子运输、发光、催化和细胞信号传导等多种功能。当前的合成方法，如从头设计和蛋白质工程，能够构建对化学、光学和酶促刺激响应的一维、二维和三维蛋白质系统。然而，这些方法常常受限于从头设计的不准确预测（例如，训练数据不足）或在工程化新的目标蛋白相互作用界面时功能丧失。尽管技术取得了进步，但设计能够导致多种功能输出的蛋白质和其互补物之间的动态相互作用是一个挑战。

分裂 GFP 是研究 DNA 介导的蛋白质-互补物结合（PCB）的一个优秀系统；其组成片段 GFP1-10 和 FP11 在解离时不发荧光，但可以自发结合（KD = 0.5 μM；λex/em = 488/510 nm），导致发色团成熟从而产生荧光。然而，这种结合事件要求这些片段彼此靠近，可能需要长达 24 h 才能达到最大荧光。因此，作者假设 DNA 支架可以控制这种结合平衡。在这个结构中，GFP_1-10和 FP₁₁分别连接到单独的DNA链上（方案1 中的1和2），这些链可以双链化以实现端对端分离；这个刚性的双链支架（方案1 中的3）限制了片段之间的结合。当移除双链化链时，形成了一个灵活的单链支架，允许蛋白质自发结合（方案1 中的4）。通过双链化不同长度的 DNA 链可以改变支架的刚性，从而影响这些片段之间的结合程度。

方案1. DNA 支架介导的GFP_1-10和 FP₁₁蛋白补体结合调控

研究低于 0.1 μM 和 0.5 μM 的浓度下的支架蛋白，评估分子间相互作用是否影响蛋白质-补体结合（PCB）。根据时间依赖的荧光测量结果，0.5 μM 的 1 和 2 的混合物比 0.1 μM 高出约 33 倍的荧光。这个结果被用作基线，以测量 GFP1-10 和 FP11 之间的分子间蛋白结合。在该解离常数条件下，刚性支架 3 上的分裂 GFP 的荧光比未连接的对照组弱约 56%（图 1a；6）。假设在浓度等于或高于 KD 时，支架蛋白的荧光主要来自分子间相互作用（例如，支架之间的二聚化；图 1a，7）。然而，在 0.1 μM 时，未连接的 6 的荧光比刚性支架 3 减少了 30%，作者提出支架蛋白 5 中观察到的荧光来自于分子内相互作用。在 0.1 μM 时，对 3 进行TMSD（支点介导的链替换）表明，DNA 支架的刚性抑制了分子内 PCB。当用链 B’置换后，得到的柔性 DNA 支架 5 的荧光增加，表明 PCB的程度更大（图 1b）。因此，所有后续分析都在 0.1 μM 下进行，以最小化不希望的分子间相互作用。通过引入置换链 B’，可以时间控制 PCB 的程度（图 1c）。当在置换后添加链 B 以恢复刚性支架 8 时，荧光没有显著变化。因此，恢复支架刚性的 DNA 相互作用并没有诱导 GFP1-10 和 FP11 解离。该观察结果与先前的报告一致，即 GFP1-10 和 FP11 之间的非共价相互作用导致观察到不可逆的结合。因此，本工作中使用的DNA 相互作用不能超越 GFP1-10 和 FP11 之间的结合。

图 1. 蛋白结合的荧光检测

紧接着，作者研究了 DNA 支架长度对蛋白质-互补物结合的影响，通过比较刚性和柔性状态下的荧光来研究。重要的是，在 38 至 58 个碱基对的范围内，刚性支架的 PCB 程度随着支架长度的增加而增加。更长的支架更灵活，因此允许更多的结合事件，而较短的支架更刚性，阻止了支架蛋白片段之间的结合，尽管在 45 个碱基对以上增加的幅度较小。此外，随着支架长度的增加，柔性和刚性支架之间的 GFP 荧光差异变得更加明显，表明支架的灵活性对 PCB 有更大的影响（图 2a）。然而，当合成了一个 78 个碱基对的支架作为极端长度来研究时，荧光强度的差异很小，表明存在一个临界长度，超过这个长度后蛋白质结合就不再依赖于支架长度，表现为每个互补物都自由存在于溶液中。从图 2b中，观察到 GFP 荧光与链 B 的长度成反比。在 30- 和 25-mer 互补链之间观察到最大的荧光差异（分别为 52%和 43%双链化）。认为这种趋势是由于 DNA 双链化和 GFP1-10 与 FP11 互补之间的竞争效应：低于特定的 DNA 长度时，GFP1-10 和 FP11 的结合超越了刚性 DNA 双链的热力学稳定性。此外，当支架的刚性从 78% 变为 0% 时，荧光增加了 7.5 倍。从这些结果推测支架双链化的比例直接影响其刚性，因此影响支架上的 PCB。

图 2. 不同 DNA 支架的长度对 PCB 的影响

DNA 支架的序列特异性应该能够实现对 DNA 双链化的正交控制，从而为选择性和可编程的 PCB 提供可能性。为了测试这个假设，改变了一个三元蛋白支架的每个部分的刚性，以调节不同蛋白质组之间的结合事件（图 3a）。组装的分裂荧光蛋白 CFP1-10-FP11 和 YFP1-10-FP11 的UV-vis 激发/发射光谱被用来测量蛋白质片段结合事件。然后，每个蛋白质片段-DNA 构建被组装并连接成一个三元支架（图 3a）。接下来，通过引入链 E’ 或 F’ 来评估 PCB 的选择性，以促进 FP11 和 CFP1-10 之间的结合形成 CFP，或 FP11 和 YFP1-10 之间的结合形成 YFP。随着时间的推移，在完全刚性的支架上，CFP 和 YFP 的荧光强度都略有增加。随着链 E 的 TMSD 的开始，观察到 CFP 荧光的增加，但 YFP 没有，这表明它们的结合受选择性控制（图 3b）。类似地，对链 F 进行了 TMSD，导致 YFP 荧光选择性增加（图 3c）。从这些结果得出结论，序列特异性的DNA 相互作用使得在多蛋白构建中对不同的 PCB 集有正交控制。最后，假设使用不同化学计量比的链 E’ 和 F’（从 0:6 增加到 6:0）将产生不同的 CFP 与 YFP 比例。在与各自的链组合过夜孵化后，CFP 荧光强度随着链 E’ 与 F’ 比例的降低而降低（图 3d）。另一方面，YFP 荧光强度增加。假设 CFP1-10、FP11 和 YFP1-10 之间的结合亲和力差异将竞争性结合平衡移向连接到更灵活区域的蛋白质。总的来说，这些结果表明，增加目标 DNA 链的比例可以有选择性地增强这些多蛋白组装中相应目标蛋白质的竞争结合。这种控制可以调节高阶蛋白中特定蛋白-蛋白相互作用的效率。

图 3. DNA支架的序列特异性对双链DNA实现选择性正交控制和可编程 PCB

本文利用 DNA 支架控制蛋白质间相互作用的新方法，特别是针对分裂绿色荧光蛋白（GFP）片段的结合。通过调整 DNA 支架的长度和刚性，可以显著影响蛋白质片段间的结合程度，从而精确调控蛋白质的功能。这项研究展示了通过 DNA 杂交实现对多蛋白体系中特定蛋白质相互作用的独立和动态控制，为开发新型生物体系和调控复杂生物功能提供了新策略。

文章作者：YJ

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.4c11315

责任编辑：WXL

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