分享的是一篇近期发表在期刊 JACS 上的文章。文章标题是“Sialylation Shields Glycoproteins from Oxidative Stress: Mechanistic Insights into Sialic Acid Oxidation and Structural Stability”，本文的通讯作者是来自南开大学化学学院的李功玉特聘研究员（研究方向：D-蛋白质谱分析）和付浩浩副研究（研究方向：分子模拟增强采样算法和自由能计算）。
在本文中，作者通过一种微尺度低温等离子体（microLTP）装置，模拟了细胞中复杂的氧化应激环境，并结合高分辨率质谱分析（MS）和密度泛函理论（DFT）计算，首次完整绘制了两种常见唾液酸（Neu5Ac 和 Neu5Gc）在自由基氧化条件下的氧化路径图。并进一步使用人转铁蛋白（hTF）作为模型，根据一系列 LC-MS/MS 位点定位、唾液酸化特异性酶处理和 AIU-IM-MS 技术，确定了特定蛋白质的结构基序和唾液酸化模式。（Scheme 1）
microLTP 衍生的 ROS 的表征
优化研究表明，microLTP 处理时间和外部高压功率幅度会显著影响 ROS 的产生。在相同条件下，ROS 丰度顺序为：H₂O₂ > O₂⁻ > ¹O₂ > •OH。通过调控 microLTP 参数可生成特定浓度范围的 ROS，为后续实验确定了 ROS 生成的最佳条件。
唾液酸的深度自由基氧化
为了探究反应机理，作者计算了反应中间体的自由能（图 1d-f），结果表明与不同量的 O₂ 反应时，会产生不同的稳定异构体产物和反应路径。Neu5Ac 与 Neu5Gc 的羟基差异如图 1g 所示，作者进一步测量了 Neu5Ac 与 Neu5Gc 的氧化动力学曲线，发现 Neu5Gc 因多一个羟基而表现出更强的抗氧化能力。
如 Scheme 2 所示，作者通过 microLTP 生成了 Neu5Ac 氧化的 46 种中间体和产物，包括侧链氧化（步骤 I–III）和环断裂（步骤 IV）的逐步路径，并通过 DFT 计算和质谱验证了各步骤的异构体及热力学稳定性。
hTF 的唾液酸化依赖性结构稳定性
传统 CIU 为 hTF 产生了不同的电荷态依赖性去折叠模式，当将数据集转换为 AIU 模式（图 2g）时，可以直接明确地比较具有不同处理的 6 个 hTF 样本的去折叠行为。通过比较氧化后 hTF 的 CCS、AIU5 和 RMSD 数据，发现唾液酸化显著提升了蛋白抗氧化的能力。
唾液酸化 hTF 的自由基氧化曲线
根据酶处理后的氧化水平变化，将鉴定出的肽分为两类：上调（I）和下调（II）。I 组肽（如 47-60、531-541等）氧化水平显著上调，对自由基氧化反应性更高；II 组肽（如 70-107、123-132等）氧化程度显著降低（图 3a）。从 hTF 的 3D 结构来看（图 3b、c），I 组肽大多位于 C 端且靠近糖基化位点（Asn432 和 Asn630），说明糖基化可能对抵抗主链氧化有保护作用；而 II 组肽氧化水平降低可能是因为去除游离寡糖后结构重排造成的。这些结果进一步揭示了糖基化修饰和氧化作用在影响蛋白质结构稳定性方面的复杂相互作用。
图 3. 受唾液酸化和 N-糖基化调节的 hTF 的自由基氧化曲线
随后，作者还全面表征了在不同血浆处理时间下在 Asn432 和 Asn630 位点的糖型变化（图 4c、d），发现有唾液酸化的糖在 Asn432 和 Asn630 位点随时间增加而减少，且不同数量的唾液酸化糖型比例进一步证明了唾液酸化糖的氧化降解。
综上所述，本研究首次揭示了唾液酸化修饰在保护蛋白质结构和功能免受氧化应激损伤中的分子机制。这一发现不仅为理解糖基化在细胞应激中的作用提供了新的视角，还为开发更稳定的蛋白质药物开辟了潜在的创新方向。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c14454
