J. Am. Chem. Soc. | 通过氨基肽酶生成含有游离N端半胱氨酸的蛋白质

为大家介绍的是最近在JACS上报道的一篇标题为 “Generation of Proteins with Free N‑Terminal Cysteine by Aminopeptidases” 的文章。该文的通讯作者是俄亥俄州立大学化学生物学系的裴德华教授。在本文中，作者报道了一种高效简便的蛋白质N端游离半胱氨酸残基的产生方法，通过基因工程的方法添加一段M-P-C序列到蛋白质N端，随后即可在脯氨酸氨基肽酶的作用下切割产生游离Cys残基。

蛋白质的位点特异性修饰在基础研究和生物技术中具有重要的应用价值，比如进行定点荧光标记、与聚合物偶联以提升药物化学性质等。其中，蛋白质的N端修饰尤为引人注目，这是由于N端常常暴露在溶剂中，所以N端的修饰不太可能对蛋白质的折叠或功能产生不利影响。N端游离的半胱氨酸残基可以发生多种生物正交偶联反应，有很大的应用价值。然而，目前为止在蛋白质N端添加游离Cys的方法都有局限性。直接表达可能受到原核系统或真核系统翻译后修饰的影响，而使用序列选择性酶切(如TEV酶切序列)的方法则受到反应效率和位点特异性低的影响。因此，亟需建立一种高效、便捷、位点特异的蛋白质N端半胱氨酸残基的构建方法。

该工作设计了一种N端三肽构建Met-Pro-Cys，通过脱甲酰基酶(PDF)和甲硫氨酸氨基肽酶(MetAP)共同去除N端Met。此时脯氨酸能够作为半胱氨酸的保护基，防止其被细胞内的醛和酮修饰。纯化该蛋白后，在体外通过脯氨酸氨基肽酶(ProAP)去除脯氨酸保护，所得到的N端半胱氨酸可以与硫酯、CBT衍生物或其他试剂特异性反应。 (图1)

图1. 通过氨基肽酶生成蛋白质中N端半胱氨酸及后续偶联修饰的示意图

作者团队首先筛选和鉴定了凝固芽孢杆菌(B. coagulans)来源的脯氨酸氨基肽酶的最佳底物。构建了一个连接在树脂上的短肽库PCX₁X₂X₃X₄，其中X为除了Met和Cys之外的其他18种氨基酸。由于脯氨酸会被ProAP切割从而释放出游离Cys，其可以与Dabcyl-CBT形成粉红色加合物。因此，可以从装载了不同序列的树脂所产生的颜色中判断酶切反应的偏好。最终构建了由约210000个树脂组成的肽底物库，通过高通量筛选和分析，得出了ProAP对不同位点氨基酸的选择偏好。X₁偏向于小氨基酸如Gly，X₂位点为Ala或His时有相似的反应效率，X₃和X₄位点则偏好于碱性氨基酸如Lys和Arg。因此，最终得到ProAP最佳反应序列为Pro-Cys-Ala(His)-Lys-Lys。(图2)

图2. 构建多肽库筛选测定ProAP的底物特异性和偏好

随后，作者团队进行了动力学实验，验证肽段序列对酶切反应的影响。他们构建了11种多肽序列，分别包含ProAP偏好序列和非偏好序列。用UPLC监测酶切反应的进行程度和速率。相比起肽11(阴性对照，包含多个ProAP不偏好位点)，其他几种肽序列呈现了约100倍的速率提升，其k_cat/K_M值在2.8−8.3×10⁵ M⁻¹s⁻¹之间，表明了ProAP的高效性和序列特异性。(表1)

表1. ProAP对不同多肽底物的酶切反应动力学常数

随后，该团队通过一个模型肽来验证该酶应用于多肽N端半胱氨酸偶联反应的能力。通过UPLC监测反应程度，将模型肽8(序列见表1)和ProAP反应，处理60分钟后肽8的UPLC峰消失，出现了产物12的峰。再将该产物12与荧光素-硫酯(FAM-CO-SR)进行NCL反应，可以从UPLC中找到偶联产物的峰，其荷质比m/z为1061.3，与偶联产物一致，证明了多肽偶联反应的成功进行。(图3)

图3. 多肽8的N端酶切反应及荧光素标记

最后，该团队选择了c-Raf的RAS结合结构域RBDV作为模型蛋白验证ProAP在蛋白质层面产生N端游离Cys的能力。将酶切序列PCGHKP通过基因工程的方法克隆到 RBDV的N端，在体外用ProAP处理底物，通过质谱确认了酶切反应产物的荷质比m/z为6877.60。然而，该反应速率较缓慢，需要6小时才能完全反应，因此作者添加了两个GSS亲水连接子来避免RBDV结构对其产生位阻，将完全反应的时间缩短至1小时以内。随后，作者同样使用FAM-CO-SR进行NCL偶联，通过质谱和荧光蛋白质凝胶电泳确定了偶联物的成功生成。他们还选择了一个环状细胞穿膜肽CPP12，通过Cys-CBT偶联反应将其连接至RBDV的N端，同样通过SDS-PAGE和质谱确认了偶联物的成功生成。(图4)

图4. 通过生成N端游离Cys将荧光素和穿膜肽CPP12偶联到RBDV的N端

综上所述，该工作报道了一种高效、方便的方法，可以位点特异性地在蛋白质或多肽N端产生游离半胱氨酸残基，并能用于后续偶联反应的方法。该方法的一个关键优点是，ProAP只从蛋白质的N端去除一个脯氨酸，而不会导致蛋白质其他序列的非特异性裂解。作者通过序列筛选和动力学实验，鉴定了ProAP的最优反应底物，并将这个序列连接到多肽或蛋白质上，验证了酶切和Cys偶联反应的成功发生。

作者：DYH 审校：LJH

DOI: 10.1021/jacs.2c07420

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c07420