分享一篇发表在Chemical Science上的文章，题目为Chemotranscriptomic profiling with a thiamine monophosphate photoaffinity probe。文章的通讯作者为荷兰Radboud大学的Willem A. Velema助理教授，其主要研究方向为核酸化学生物学和细菌耐药性机制。

核糖开关（riboswitches）是一类扮演生物传感器功能的非编码RNA元件，它们在结合小分子代谢物后发生构象改变，从而调控转录或翻译（Curr Biol. 2023; 33(9): R343-R348）。目前已知核糖开关结合的小分子通常具有扁平的杂芳环结构和带电基团，以黄素单核苷酸（FMN）和焦磷酸硫胺素（TPP）等为代表。单磷酸硫胺素（TMP）是TPP生物合成的中间体，但其生理功能尚未知。近年来，通过光化学方法捕获小分子-RNA结合事件显示出了巨大的潜力，受此启发，本文中作者设计通过光交联探针在大肠杆菌（E. Coli）转录组中鉴定TMP结合的RNA。

首先，作者通过在TMP的噻唑鎓环甲基上引入光反应性基团（双吖丙啶）和生物正交把手（炔基）构建了光交联探针1。作者使用1与E. Coli的总RNA进行孵育，随后使用紫外光进行光交联，捕获潜在的相互作用。经CuAAC反应富集后，通过下一代测序鉴定被富集的RNA（以DMSO为对照）。作者对这些富集得到的RNA进行了初步筛选，将目光集中在具有代谢物结合口袋特征的RNA上（>50 nts且具有5′ UTR），在此条件下注意到了三种转录本：rnpB、prs和ribB。随后，作者通过RT-qPCR验证了1对ribB具有显著的富集，而对rnpB和prs没有。值得注意的是，ribB此前分类为结合FMN（而非TMP）的核糖开关。作者通过对照探针、±UV和加入 FMN的竞争性实验进一步证实了1对ribB FMN适配体部分的选择性结合，提示这种FMN结合RNA很有可能也结合TMP。

为了确定ribB上的TMP结合位点，作者使用了逆转录终止测定法：RNA的逆转录会在与探针交联的位置处终止。通过对所得的截短cDNA序列进行分析，作者鉴定到了 G115 和 G154 处的逆转录终止，这种逆转录终止依赖UV照射，且可以被 FMN竞争。这两处位点都位于ribB的FMN适配体区域，作者也通过分子对接预测了TMP与该口袋的结合模式。

随后，作者通过SHAPE（Selective 2′-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension）分析验证了未修饰的TMP与ribB的结合。最后，作者使用体外转录/翻译（IVTT）方法测试了TMP结合对ribB所调控的基因表达的影响。作者将萤火虫荧光素酶基因连接到ribB 核糖开关的下游，通过报告基因表达的荧光信号读出核糖开关的转录/翻译调控变化。有趣的是，与已知配体FMN相反，TMP的结合增强了ribB下游基因的表达，可能具有一种独特的结合和调控模式。

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总结而言，本文通过TMP衍生的光交联探针，在大肠杆菌转录组中鉴定了潜在的TMP结合RNA，并将ribB鉴定为一种新的TMP结合RNA。

本文作者：TYC

责任编辑：MB

DOI：10.1039/D4SC06189F

原文链接：https://doi.org/10.1039/D4SC06189F