分享一篇发表在Cell Chemical Biology上的文章，题目为“Antibiotic target discovery by integrated phenotypic and activity-based profiling of electrophilic fragments”，通讯作者是来自康奈尔大学分子化学与化学生物学系的Hening Lin教授和Mikail E. Abbasov教授，他们的研究方向分别是酶促翻译后修饰以及化学蛋白质组学，Mikail E. Abbasov教授在博士及博士后期间师从Benjamin Cravatt教授。这篇文章中作者提出了一种发现抗生素靶标的方法，通过结合半胱氨酸反应性片段的竞争性ABPP方法与表型筛选方法来筛选靶标。

抗生素耐药性是危及全世界的医疗问题。传统的抗生素针对有限的几种机制，比如细胞壁破坏、蛋白、核酸合成，因此，研究人员尝试提出针对新的机制的抗生素，用来解决抗生素耐药性问题。为了快速寻找新的抗生素靶点并开发先导化合物，作者筛选了半胱氨酸反应性化合物库，通过寻找共价反应性的蛋白，从而扩大细菌蛋白质组中的可成药的蛋白库。作者应用了一个含有3200种共价配体片段的大型库用于筛选，在金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌中分别鉴定到48和17种化合物抑制细菌生长，然后排除了在HEK293T细胞中存在高毒性的11种化合物。这其中，氯甲基酮弹头表现出低细胞毒性和较强的抑菌能力。作者选定了带有氯甲基酮弹头的化合物10-F05作为先导化合物，因为它表现出对多种细菌的广谱抗菌效果。

作者发现10-F05可以对革兰氏阴性菌和阳性菌都有良好的杀菌效果，细菌对其产生耐药性比传统抗生素要慢很多，且与其他抗生素没有交叉耐药的行为。这说明10-F05可能存在新作用机制。

作者使用竞争性ABPP策略寻找10-F05的靶标。在福氏链球菌中鉴定到588种蛋白的1035个半胱氨酸，数据库预测其中103种是该细菌必需的。在这些靶标中，作者关注到FabH，MiaA和PdxY蛋白，所鉴定到的半胱氨酸位点均参与重要的生物过程，包括脂肪酸生物合成，tRNA修饰及磷酸吡哆醛挽救。作者纯化了这几种蛋白，证明10-F05可以竞争掉IA荧光探针的信号，支持10-F05修饰在半胱氨酸上。

接下来，作者进一步研究了这几种靶蛋白对抗菌的作用。对于FabH，这是一种已知的抑菌靶点，所鉴定到的C112位点是保守的催化位点。作者用它的抑制剂处理细菌，发现细菌的生存与10-F05相似，说明10-F05抑制了FabH导致细菌死亡。作者还利用过表达和敲除实验进行证明，结果显示过表达相关蛋白后，细菌对10-F05更不敏感，反之亦然，说明这些蛋白在杀菌过程中起到关键作用。其中YiiD蛋白参与了绕过FabH抑制的通路，因此它的过表达使FabH被10-F05抑制的事件更不致命了。

对于MiaA，作者鉴定到的C273位点位于tRNA结合位点附近，预测共价对接结构显示10-F05修饰可能干扰tRNA结合。实验验证加入10-F05后游离tRNA的确增多了。并且10-F05处理使MiaA酶活降低了（图5E）。作者进一步通过实验证明了MiaA的抑制导致翻译错误率增加（图6B），并且导致细菌的抗逆性变差。

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总之，本文作者提出了一种发现抗生素靶标的方法，通过结合半胱氨酸反应性片段的竞争性ABPP方法与表型筛选方法来筛选靶标。作者发现FabH和MiaA是片段10-F05的主要靶标。作者验证了FabH的共价C112修饰和MiaA的C273修饰在抗菌过程中发挥重要作用。

本文作者：WYJ

责任编辑：WYQ

DOI：10.1016/j.chembiol.2025.02.001

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2025.02.001