分享一篇近期发表Biomaterials上的文章，题目为In situ customized apolipoprotein B48-enriched protein corona enhances oral gene delivery of chitosan-based nanoparticles。文章的通讯作者是复旦大学的印春华教授。
通过基于葡聚糖或壳聚糖的微纳米粒子负载基因实现口服递送能够克服裸基因口服在通过消化道时面临的挑战，而对口服递送基因的机制的研究有望提升递送效率。纳米粒子在口服施用后会与体内液体和组织中的离子和蛋白发生作用，产生生物特性，从而影响其口服递送。
蛋白冠的形成会影响纳米粒子的尺寸、表面电荷、生物分布等，因此本文作者希望对基于壳聚糖的纳米粒子在口服递送后的生理条件下形成的蛋白冠进行研究。为此，本文作者通过在不同分子量的壳聚糖上连接了季铵基团和半胱氨酸合成了七种不同的三甲基壳聚糖-半胱氨酸聚合物（TC1-TC7）。通过磷酸三聚酯钠（TPP）存在下质粒与TC的静电相互作用，作者能够将质粒封装在其中形成TC1-TC7纳米粒子。如图1所示，DLS显示，随着季铵化和半胱氨酸化程度的增加，TC纳米粒子的尺寸先减小再增大，而随着壳聚糖分子量从5kDa增加到1000kDa，TC纳米粒子的尺寸先减小再显著增大。作者还通过SEM表征了TC纳米粒子的不同形貌。作者通过琼脂糖凝胶电泳证实了七种纳米粒子都能成功负载质粒DNA，且能够在胃液、小肠液、小肠匀浆以及血清中保护DNA不受降解。在细胞内，TC纳米粒子能够响应谷胱甘肽释放出质粒DNA，且释放速率随分子量和季铵化程度的增加以及半胱氨酸化程度的降低而降低。
图2. 离子与蛋白冠对TC纳米粒子尺寸和稳定性的影响
如图2所示，本文作者将TC1-TC7纳米粒子分别在PBS、10%FBS和含有10%FBS的PBS中孵育，再利用DLS表征其尺寸。PBS的孵育会引起低分子量的TC1的尺寸增加，而分子量较大的TC2-TC7由于更多的分子内氢键的作用能更好地耐受离子的影响。而在FBS的存在下，半胱氨酸化程度高的TC6和TC7尺寸显著减小，这是由于其表面游离的巯基和FBS中蛋白的巯基形成了二硫键。基于此结果，作者选取了TC1、TC2、TC4、TC7进行后续研究。在不添加胃蛋白酶和胰蛋白酶的模拟胃液（SGF-）和模拟小肠液中（SIF-）中，四种纳米粒子的尺寸都不发生明显变化，但在有酶存在时，TC1、TC2、TC4的尺寸会显著增大，而TC7的尺寸显著减小，证实了生理环境中酶的吸附确实会影响纳米粒子的尺寸。此外，胶图证实了四种纳米粒子都能在各种模拟胃肠道环境下保护质粒DNA的稳定。
如图3所示，作者探究了TC纳米粒子口服蛋白冠的形成。首先，作者对不同TC在小肠匀浆中吸附的蛋白进行了SDS-PAGE表征， 四种TC都对分子量在40-60kDa的蛋白有较多吸附，而TC-7还能够吸附250kDa的蛋白。将胶图条带依次进行LC-MS/MS分析并绘制热图，作者证实其口服蛋白冠中的蛋白涉及胞吞作用、胞吐作用和乳糜微滴的形成。TC1、TC2、TC4与TC7蛋白冠组分的不同证实了其不同的细胞摄取方式和胞内命运。通过蛋白免疫印迹法，作者证实250kDa处的条带是载脂蛋白ApoB48，对其进行MD模拟，TC7显示出比TC4更强的与ApoB48的结合能力。
图4. TC的细胞摄取和细胞内共定位以及跨小肠上皮细胞运输
如图4所示，作者表征了蛋白冠对TC纳米粒子口服运输的影响。在FBS的存在下，TC7的细胞摄取显著增加，这可能是由于FBS中的蛋白吸附减小了TC7的尺寸，且通过添加不同细胞摄取方式的抑制剂证实了TC7的摄取主要通过小窝蛋白介导。荧光成像显示TC7主要与内质网以及高尔基体共定位，这与其内吞方式一致。加入高尔基体到膜运输路径的阻断剂，TC7的运输被显著抑制。在大鼠模型中，TC7与其他TC纳米粒子相比更多地出现在小肠绒毛处，与淋巴毛细血管共定位，证实了TC7能够很好地被小肠细胞内化并被运输到淋巴循环。
图5. 口服施用负载质粒的TC纳米粒子的体内抗癌能力
由于TC7纳米粒子能够通过吸附ApoB48从而靶向巨噬细胞，实现肿瘤积累，作者用其负载具有抗癌作用的iSur质粒以验证其抗癌效果。如图5所示，TC7纳米粒子能够有效抑制肿瘤体积的增长，效果好于其他TC纳米粒子。对于组织形态学的染色与分析也证实了其抗癌能力。
综上所述，本文作者制备了不同分子量、季铵化比例和半胱氨酸化比例的壳聚糖纳米粒子用于质粒的负载，通过分析其在口服递送过程中形成的蛋白冠种类以及对其粒径的影响，作者筛选出具有高分子量、中等季铵化比例以及高半胱氨酸化比例的壳聚糖纳米粒子具有好的肠道细胞摄取和转运，并能够通过对AgoB48的吸附靶向巨噬细胞从而在肿瘤富集，利用此纳米粒子口服递送基因具有较好的治疗癌症效果。
DOI: 10.1016/j.biomaterials.2024.122704
Link: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122704
