分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为“A Site-Specific Photo-Crosslinking Proteomics ApproachProvides Insights into Non-Canonical Pyroptotic Caspase-4Substrates”，通讯作者是来自清华大学的尹航教授，其研究兴趣是药物发现，蛋白质工程和生物技术开发。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）是一种参与多种生命活动的半胱氨酸型内肽酶。在非经典炎症中，caspase4/5独立于炎症小体，直接被细胞内脂多糖激活，裂解gasdermin D (GSDMD)，导致多聚体N-GSDMD孔在细胞膜上组装并释放细胞溶质分子。然而对于caspase4的底物的有限理解限制了对其的进一步研究。本文结合遗传密码子扩展，光交联和蛋白质组学，鉴定了caspase4的底物网络。

Caspase4本身以无活性的酶原形式表达，在保守蛋白结构域p22和p10之间自切割后被激活，可以结合底物蛋白并显示切割活性。于是作者为了鉴定caspase4的底物，将活性切割位点C258位突变为A，同时在p22和p10结构域直接添加HRV-3C切割位点，用于形成激活的Caspase4。最后还在底物口袋掺入非天然氨基酸pBpa，使用光交联方法固定Caspase4和底物的相互作用。作者首先验证了这种改造的探针可以维持天然构象与底物结合能力。

然后作者使用无标定量的蛋白质组学技术对+/-UV组在THP-1细胞裂解液中鉴定出156种潜在底物。为了验证蛋白质组的鉴定结果，作者选取部分蛋白进行验证，30个测试蛋白中有16个可以被有效切割。

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最后作者关注于AKT1蛋白，发现AKT1的切割位点位于D108，裂解位点D108正好位于PH结构域的末端，一个自我抑制和膜定位结构域的裂解可能会影响AKT1的激活或定位。作者还发现了Caspase-4对同家族蛋白酶Caspase-5/12前体的激活作用，揭示CASP4下游存在一个未知的复杂焦亡级联。

总的来说，本文通过结合基因编码扩展、光交联和蛋白质组学，采用了一种独立于蛋白水解的方法来分析caspase-4的底物。

本文作者：YDP

责任编辑：WYQ

DOI：10.1002/anie.202501535

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202501535