分享的是一篇发表在 Angewandte Chemie International Edition 上的文章，标题是“Site-Selective Construction of N-Linked Glycopeptides through Photoredox Catalysis”，文章的通讯作者是来自上海交通大学的王平教授，他的课题组主要从事化学合成具有重要生理活性的糖蛋白和糖肽、糖类分子合成及其方法学研究以及多肽合成方法学研究。
蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，对于宿主与病原体相互作用、调节免疫反应、促进蛋白质折叠和维持蛋白质的稳定性至关重要。在不同类型的聚糖中，N-聚糖是一种广泛且保守的翻译后修饰，存在于大多数细胞表面。N-聚糖在优化治疗肽和蛋白质方面发挥着至关重要的作用。然而，由于使用当前的基因表达系统难以获得同质糖蛋白，研究糖蛋白结构与功能之间的关系一直具有挑战性，因为通过非模板化翻译后糖基化生物合成的糖蛋白通常以难以分离的复杂混合物形式产生。
为了解决这个问题，人们已经开发了多种方法来化学组装 N-连接的糖肽。除了在固相肽合成期间使用糖基氨基酸制备糖肽之外，Lansbury 及其同事开发的一种合成方法也被广泛采用，该方法将中等大小的部分保护的肽与自由的糖基残基和糖基胺结合以产生糖肽片段（方案 1A）。然而，这种方法有着偶联产率低、糖胺易分解等缺点。而可见光氧化还原催化的最新进展带来了新的合成手段。脱氢丙氨酸（Dha）是一种天然存在的非经典氨基酸，可以通过 β-消除来自丝氨酸（Ser）的羟基或来自半胱氨酸（Cys）的硫基来有效地掺入肽中。因此，修饰 Dha 是一种有吸引力的方法，可以高效地对肽和蛋白质进行位点选择性修饰。目前已经开发了一系列针对 Dha 的肽的复杂光氧化还原方法，然而，通过光氧化还原催化合成 N-连接糖肽的潜力（增强不同 Dha 功能的重要策略）仍然没有得到充分研究。
在这篇文章中，作者首次报道了 N-糖基草胺酸与含有 Dhas 的复杂肽的可见光介导的吉斯反应，通过后期修饰方法产生了 N-连接的糖肽（方案 1D）。该反应在温和条件下表现出对各种肽功能团（例如酸、胺、醇和吲哚）的高垂直反应性。它促进了复杂肽（例如硫链菌素）的直接修饰，而使用之前的方法实现这一目标是十分困难的。此外，在胎牛血清存在下，用聚糖修饰的肽显示出改善的抗肿瘤活性和稳定性。
方案 1 光氧化还原催化合成 N-连接糖肽的方法进展
肽的有效 N-糖基化需要在温和的反应条件下进行位点选择性和功能团相容性，以避免其他光不稳定残基的干扰。因此作者认为在复杂肽环境中将糖基化氨甲氧自由基与 Dha 的位点选择性吉斯加成是更好的选择。
作者首先进行了含有 Dha 的模型肽的制备。经过大量实验和反应条件的优化，在 35°C、蓝色 LED 光（465 nm，40 W）下，进行肽 1 与作为自由基前体的 N-糖基草胺酸 2 的自由基偶联。12 小时后，纯化得到所需的 N-连接糖肽 5-a 和 5-b，为两种非对映体的几乎相等的混合物，LC-MS 产率为 71%，具有高位点选择性（方案 2D，条目 1）。两种非对映体（5-a 和 5-b）的结构通过合成标准糖肽得到了确认。而在没有照射的情况下，未检测到所需产物的痕迹（方案 2D，条目 5）。如方案 2F 所示，使用优化的光氧化还原条件，肽 1 与含有不同低聚糖基团的各种 N-糖基草胺酸反应。这些试剂可以很容易地从糖胺或糖基叠氮通过三步制备，产率很高。总的来说，可以优异的产率获得含有单糖、双糖和三聚糖的糖肽（6-14），而其中含有三糖基序的产物 14 的产率超过 84%。并且方案 2G 显示，所选反应混合物的图谱表明反应以高选择性进行，仅产生微量的副产物。
方案 2 光氧化还原催化制备 N-连接糖肽的进展。
接着作者使用源自不同长度和组成的天然蛋白质的肽受体进一步探索了这种糖基化方法的范围（方案 3A）。作者，含有 11-18 个氨基酸的 TIGIT（T30-S40，15）、SIGLEC-15（A166-A180，16）和 PD-1（L65-F82，17）与 N-糖基草胺酸 2 反应良好，在蓝色 LED 照射下产生 N-糖基化肽（20-22），产率为 62%-85%。而中等大小的肽（22-34个残基）在这种转化中也表现良好。当用 N-糖基草胺酸 2 进行糖基化时，PD-L1（F211-A232，18）和 HSV-1 的 gD（R92-F125，19）产出了 N-糖肽（23 和 24），产率为 60%-68%。值得注意的是，化学合成的糖肽适合于酶促糖基化。如方案 3B 所示，使用糖基转移酶 Endo-M N175Q 修饰糖基化肽 SIGLEC-15（A166-A180）片段 21 和 PD-L1（F211- A232）片段 23 以构建复合 N-糖肽。这些糖肽的两种非对映体（21 和 23）与唾液酸化的糖基氧唑嗪反应，以优异的产率产生所需的复合糖肽（25 和 26）。
然后作者发现这种转化对一系列生物活性肽和肽药物均有效，例如特利加压素（用于治疗肝肾综合征）、Lynronne-1（一种抗菌肽）和替加波肽（用于治疗晚期激素难治性前列腺癌）（方案 4A）。所有这些生物活性肽都经过位点选择性吉斯反应，产生所需的 N-糖肽（27-29），LC-MS 产率范围为 64%-77%。并且值得注意的是，特利加压素是一种具有一个二硫桥的环肽。这些例子表明，这种自由基介导的方法与所目标肽中的所有蛋白质原氨基酸（除自由半乳糖外）相容。而该反应的实用性在抗生素硫链菌素的后期功能化中得到了进一步证明。硫链菌素是一种由 26 个氨基酸组成的环形复杂肽，它合成的挑战性和溶解性差限制了其在临床中的使用。作者使用新的合成方法对 Dha 16 进行了糖基化，合成了 30，LC-MS 产率为 47%。通过核磁共振光谱法证实了修饰肽（30）的结构。
之后作者评估了修饰肽的生物活性，发现 Lynronne-1 在修饰后保留了显著的抗菌功效，最低抑制浓度（MIC）为 8 μg/mL。并且有趣的是，Lynronne-1（28，L/D）的糖基化变体在胎牛血清中表现出了稳定性的增强，超出了作者最初的预期。同时，作者使用 MCF-7 乳腺癌细胞系评估了修饰后的替加波肽 29 的抗肿瘤活性。结果表明，与未修饰的替加波肽相比，糖基化形式的替加波肽表现出更好的抗肿瘤性能。
最后根据实验结果和现有文献，作者提出了该反应的可能机制（方案 5）。在蓝色 LED 照射下，[IrⅢ]*（E1/2 red [IrⅢ*/IrⅡ] = +1.21 V vs SCE in CH3CN）产生光激发。在铯存在下，草胺酸 31 被转化为草酸盐 32。草酸盐 32 的氧化势为 +1.17V，在逐步损失一分子 CO2 后，它可以被 [IrⅢ]* 氧化，通过单电子转移（SET）形成氨甲氧自由基 33。随后 33 与缺电子 Dha 残基 34 之间发生吉斯反应产生自由基中间体 35，然后通过 [IrⅡ] 进行单电子还原形成负碳离子 36。随后进行中间体 36 的质子化，得到所需的 N-连接糖肽 37。
方案 5 提出的光催化偶联加成反应机制
总而言之，作者开发了一种使用光氧化还原催化吉斯加成合成 N-连接糖肽的通用策略。与当前依赖于形成胺键的方法不同，该策略通过 N-糖基草胺酸与含有 Dha 的肽的偶联来构建 N-连接的糖肽。这种方法条件温和，可以在广泛的肽中进行位点选择性 N-糖基化。这有助于合成含有 Dha 的其他生物活性肽的 N-糖基化肽类似物。糖基化后观察到的稳定性和活性的改善进一步证明了该策略的实用性。这种方法将为生物学和治疗研究提供一种有价值的工具。
本文作者：JX
原文链接：
https://doi.org/10.1002/anie.202415565
