分享一篇发表在Anal. Chem.上的文章，题目是“Fluorescence Lifetime Super-Resolution Imaging Unveil the Dynamic Relationship between Mitochondrial Membrane Potential and Cristae Structure Using the Förster Resonance Energy Transfer Strategy”，文章的通讯作者为河北大学化学与材料科学学院的高保祥教授。
线粒体是真核细胞中重要的细胞器，在能量产生、信号传导、和代谢调节中发挥着关键作用。MMP是一个关键参数，通过氧化磷酸化驱动ATP的产生，并调节各种线粒体功能，包括细胞凋亡和离子稳态。此外，线粒体内被称为嵴的复杂结构是细胞器结构和功能的基础，大部分电子传递链位于此处。尽管它们具有重要意义，但MMP与嵴形态之间的相互关系尚未得到很好的阐明。
以往的研究在利用荧光探针检测MMP方面有了重要的发现，加深了我们对线粒体结构和功能的理解。最初，Bereiter-Hahn和Vöth使用JC-1区分了单个线粒体内MMP的不同分布。随着成像技术的进步，Wolf等人成功地利用TMRE的荧光强度作为指标，通过共聚焦显微镜和Airyscan技术揭示了同一线粒体内不同嵴间MMP的不同分布和功能差异。Manley等人利用TMRM荧光强度的变化，观察线粒体分裂位点相对于其他区域较低的MMP，进一步阐明了MMP在线粒体裂变中的作用。随着超分辨率成像技术的发展，未来的研究将重点放在MMP的超分辨率可视化和独立于MMP的荧光探针的开发上。这些探针将利用荧光寿命等指标准确反映MMP的分布，以消除浓度、激光强度和光漂白等因素的影响。
线粒体嵴是细胞内的重要结构，通常表现出小于100 nm的膜间距离。然而，传统的荧光显微镜受到衍射屏障的限制，分辨率只能达到200 nm左右，导致嵴的精细结构无法观察到。虽然超分辨率成像在理论上提供了所需的分辨率，但它通常需要高激发光强度，这可能导致探针的光漂白，甚至增加活性氧的产生。因此，开发合适的线粒体嵴超分辨率成像探针仍然是一个挑战。我们前期的研究表明，甲氧基修饰的Si-罗丹明作为一种优良的荧光探针，具有较高的光致发光效率和光稳定性，可成功应用于线粒体嵴的超分辨率成像以及线粒体裂变、融合、凋亡等动力学监测。Xi等人设计了己酰氨基苯砷酸盐修饰的方酸菁荧光探针，通过二硫交换反应将探针固定在线粒体内膜上，实现了线粒体的长期超分辨率成像。后续的研究将利用荧光探针在线粒体超分辨率成像中的多功能性，例如，通过将线粒体超分辨率成像与MMP可视化相结合，研究人员可以显著增强对MMP和嵴结构在线粒体各种生理过程中所起关键作用的认识，促进我们对细胞功能和功能障碍的理解。
本研究设计并合成了一对FRET荧光探针（OR-LA和SiR-BA）来研究MMP与嵴结构改变之间的关系。这两种探针均针对线粒体阳离子，因其具有独特的性质而被选中。OR-LA是一种硫辛酸修饰的罗丹明染料，作为线粒体辅酶引入，不仅确保探针固定在线粒体内，还增强了生物相容性。此外，OR-LA含有一个长亲脂链段，可以促进与线粒体内膜的相互作用。通过引入以丁基部分修饰的硅罗丹明探针SiR-BA，优化了探针的膜传递时间，以有效跟踪FRET动态和检测MMP变化。如方案1所示，在线粒体去极化过程中，SiR-BA被挤出线粒体，导致SiR-BA荧光减弱，而作为荧光供体的OR-LA的荧光增强，荧光寿命增加。通过监测探针之间的荧光强度比率和OR-LA荧光寿命的增加，成功地实现了诱导MMP还原过程的可视化。
方案1. 用于可视化MMP检测变化的FRET对示意图。
首先，我们研究了OR-LA和SiR-BA在PBS溶液中的吸收和发射光谱（图1a,b）。OR-LA在563 nm处表现出明显的吸收峰和581 nm处的荧光峰，SiR-BA在658 nm处表现出明显的吸收峰和675 nm处的荧光峰。OR-LA的荧光峰与SiR-BA的吸收峰明显重叠，表明两种染料之间可能发生了FRET过程。为了验证这一过程，在PBS溶液中制备了OR-LA和SiR-BA的混合物。此外，制备了OR-LA和SiR-BA在模型膜溶液（DMPC/DMPG）中的混合物，以模拟两种染料在线粒体脂质环境中的相互作用。如图1c所示，在PBS混合溶液中，在563和658 nm处有两个明显的吸收峰，分别属于OR-LA和SiR-BA。当用520 nm激光激发时，荧光光谱中只观察到对应于OL-LA的581 nm处的荧光峰，说明在PBS溶液中，两种染料分子发生布朗运动，由于电荷的排斥性相互作用，不能在小于10 nm的距离内接近，从而阻止了FRET过程的发生。在脂质膜溶液中，除了563和658 nm处有明显的吸收峰外，在520 nm激光激发下，荧光光谱在581和675 nm处观察到明显的荧光峰（图1d），表明OR-LA和SiR-LA之间存在明显的FRET过程，说明在脂质环境中，染料分子与脂质之间的相互作用更强，使得两个染料分子之间的距离小于10 nm，从而实现显著的FRET过程。此外，我们研究了不同比例的两种染料在脂膜溶液中的FRET过程，如图1e所示。在520 nm激光激发下，随着SiR-BA比例的增加，单独的OR-LA在581 nm处的荧光峰逐渐减小，而SiR-BA在675 nm处的荧光峰逐渐增大，表明随着SiR-BA的加入，更多的OR-LA分子通过非辐射跃迁将能量传递给SiR-BA，导致其荧光减弱，SiR-BA荧光增强。
图1. OR-LA和SiR-BA的表征。
为了证实OR-LA和SiR-BA的线粒体靶向能力，我们使用商业线粒体染料MTG进行荧光共定位实验。如图2所示，HeLa细胞中OR-LA和SiR-BA的荧光信号与MTG的荧光信号重叠良好，Pearson共定位系数分别为0.91和0.90，表明这两种染料确实靶向活细胞中的线粒体。
图2. OR-LA和SiR-BA在HeLa细胞中的亚细胞共定位成像。
此外，通过SDS-PAGE实验进一步证实了OR-LA通过二硫键交换反应与蛋白质的共价结合能力（图3a），结果表明OR-LA的线粒体靶向成像不依赖于膜电位，而SiR-BA依赖于MMP。
为了在细胞水平上进一步研究OR-LA和SiR-BA在MMP下降过程中的迁移情况，我们检测了单个OR-LA和SIR-BA染色的HeLa细胞的荧光强度变化，以及与OR-LA的共染色和不与OR-LA发生荧光串扰的商业染料罗丹明123进行染色，以探索其他染料在MMP下降过程中对OR-LA定位的影响。结果表明，CCCP诱导MMP下降10 min后，单独使用OL-LA的荧光强度仍可维持在82%（图3b（上）、图3c），而单独使用SiR-BA的荧光强度仅维持在初始的28%（图3b（中）、图3c）。OR-LA和罗丹明123共染色后，OR-LA的荧光强度保持在83%（图3b（下）、图3c）。这些结果表明，在细胞中，OR-LA可以独立于MMP实现线粒体靶向成像，而SiR-BA则依赖于MMP。此外，OR-LA的MMP独立特性不受其他染料的影响，为MMP变化的荧光可视化研究提供了见解。
图3. (a) SDS-PAGE荧光图像和考马斯凝胶染色的图像。(b) HeLa细胞单独用0.4 μM OR-LA(上)、单独用0.4 μM SiR-BA(中)、单独用0.4 μM OR-LA和0.4 μM罗丹明123(下)染色30 min，然后用5 μM CCCP不同时间处理的荧光图像。(c) (b)组的荧光强度随时间的变化。(d) HeLa细胞用0.4 μM OR-LA和0.4 μM SiR-BA共染色30 min，然后用5 μM CCCP处理不同时间的荧光图像。(e) (d)中绿色和红色通道的荧光强度。(f) (d)中红色和绿色通道的荧光强度随时间变化的强度比。
接下来，用OR-LA和SiR-BA染色HeLa细胞，然后用CCCP处理，诱导MMP下降。如图3d所示，在MMP下降过程中，OR-LA的荧光强度逐渐增加，而SiR-BA的荧光强度逐渐降低，表明FRET效率下降。此外，对两种染料在此过程中的荧光强度变化进行量化，如图3e所示。最初，在MMP下降的前1.5 min内，SiR-BA的荧光迅速下降，而OR-LA的荧光迅速恢复。这一行为反映了CCCP诱导MMP的初始快速下降，OR-LA的荧光恢复幅度与SiR-BA的荧光下降表现出很强的相关性。这些结果表明，这些染料作为FRET对MMP检测的示范性性能。最后，进一步计算两种染料的荧光强度比，如图3f所示，通过荧光强度比的变化，定量监测MMP的下降情况。这些结果为研究MMP的变化提供了指导。
之前的实验结果已经证明了OR-LA独立于MMP的线粒体靶向成像性能，进一步证实了OR-LA在线粒体超分辨率成像实验中的优异性能，这对FLIM超分辨率成像的准备至关重要。用SIM显微镜对经OR-LA染色的COS7细胞进行成像，如图4a所示，可以清晰地观察到线粒体内膜的嵴结构。从线粒体局部放大图像（图4b）可以看出，OR-LA主要定位于嵴内，嵴形态清晰可见，半峰全宽（fwhm）小至112 nm，接近SIM分辨率极限，表明OR-LA用于线粒体超分辨率成像的实用性。随后，使用STED纳米显微镜进一步验证了OR-LA对线粒体超分辨率成像的能力，如图4c所示。嵴结构清晰可见，局部放大图像显示OR-LA主要定位于嵴结构内，半峰宽小至63 nm（图4d）。这些结果共同表明，OR-LA是一种适合用于线粒体超分辨率成像的具有优异光学特性的染料。
图4. (a) 0.4 μM OR-LA染色30 min后COS7细胞线粒体的SIM超分辨成像。 (b) 线粒体嵴的放大视图和分辨率图。 (c) 0.4 μM OR-LA染色30 min后COS7细胞线粒体的STED超分辨成像。 (d) 线粒体嵴的放大图和分辨率图。 (e) 不同比例的OR-LA和SiR-BA在模型脂膜溶液(DMPC/DMPG)中的荧光寿命。(f) 0.4 μM OR-LA染色30 min(左)或0.4 μM OR-LA和0.4 μM SiR-BA共染色30 min(右)COS7细胞的荧光寿命成像。 (g) COS7细胞用0.4 μM OR-LA和10 μM SiR-BA染色30 min后用5 μM CCCP处理不同时间的荧光寿命成像。
当两个染料分子之间发生FRET时，供体分子接收的部分能量发生非辐射跃迁并转移到受体分子，导致供体荧光强度和寿命降低。通常，荧光寿命是绝对的，不受激发光强度和染料浓度等因素的影响，只与染料所在的微环境有关。因此，荧光寿命显微镜可以为MMP的变化提供更准确的成像信息，更有利于获取分子状态和空间分布信息。在此，当模型膜溶液（DMPC/DMPG）中FRET分子对之间发生能量转移时，检测了供体荧光寿命的变化。如图4e所示，随着SiR-BA比的不断增大，OR-LA的荧光寿命逐渐减小，说明该FRET分子对非常适合MMP变化的视觉成像。最初，用OR-LA单独染色COS7细胞，荧光寿命显微镜显示平均染色寿命为2.721 ns（图4f，左）。随后，用OR-LA和SiR-BA共染色细胞，发现OR-LA的荧光寿命缩短至约2.060 ns（图4f，右），表明两种染料在线粒体内膜中FRET有效。然后，用OR-LA和SiR-BA对细胞进行共染色，并用CCCP诱导MMP下降。我们观察到，随着MMP的降低，OR-LA的荧光寿命从2.185 ns增加到2.734 ns（图4g），说明在MMP降低期间，SiR-BA持续从线粒体中挤出，导致之前获得的FRET效率降低，OR-LA荧光寿命恢复。这种通过荧光寿命变化来观察和监测MMP变化的方法为线粒体研究提供了新的见解。
尽管STED显著降低了染料的荧光寿命，使图像相量分离变得复杂，但FLIM超分辨率成像已成功应用于线粒体，MMP下降期间OR-LA和SiR-BA中的FRET过程减弱，荧光寿命明显增加证明了这一点。最初，仅用OR-LA染色的COS7细胞的超分辨率成像显示荧光寿命为1.698 ns（图5a，左），而在用OR-LA和SiR-BA共染色的COS7细胞中，荧光寿命明显下降至1.369 ns（图5a，右），表明线粒体膜内OR-LA和SiR-BA之间存在能量转移。从局部放大的线粒体（图5b）可以清晰地观察到线粒体嵴结构，半峰宽为98 nm，证明了利用FLIM超分辨率成像研究MMP与嵴结构关系的可行性。如图5c所示，在CCCP诱导的MMP下降过程中，图像显示荧光寿命从1.374 ns逐渐增加到1.692 ns，生动地捕捉到了线粒体嵴的逐渐扩大和破裂、空泡化、线粒体空泡化和破裂，以及线粒体在此过程中的部分融合。更详细的过程如图5d所示，从00:30到02:00，嵴间距明显增加（白色箭头所示）；从03:00到03:30，嵴明显破裂（紫色箭头所示），线粒体逐渐空泡化。值得注意的是，从00:30到04:00（红色箭头所示），在线粒体破裂部位附近观察到MMP下降率显著增加，表明MMP下降加剧可能是线粒体膜破裂的一个因素。另外，从10:00到13:30（蓝色箭头所示），圆形的线粒体开始破裂，从10:00到13:00（黄色箭头所示），线粒体发生了明显的融合过程。这些结果共同表明FRET分子成功地应用于研究MMP与嵴结构之间的关系。这种监测方法克服了染料浓度、激光强度和光漂白带来的偏差，准确反映了染料所在膜结构的特征，为线粒体结构与功能之间的关系提供了新的见解。
图5. COS7细胞中OR-LA和SiR-BA的FLIM超分辨成像。
目前，缺乏有效的可视化工具来探索线粒体嵴结构与MMP之间的动态关系。通过FRET分子对的设计，结合FLIM超分辨率成像技术，我们实现了线粒体嵴结构和MMP的同步动态监测。在这个过程中，我们观察到线粒体嵴间距的动态变化，从逐渐增大到碎裂，最终到线粒体空泡化和破裂的整个过程。特别值得注意的是，我们已经成功地确定了线粒体局部位置的MMP下降可能是这些区域线粒体膜破裂的重要指标。这种方法为线粒体研究提供了重要的见解，并有望加深我们对线粒体生物学和疾病机制的理解。这种综合方法的应用将为探索更深层次的细胞生物学问题提供新的视角和方法。
