ACS Nano |基于质谱的Top-down蛋白质组学在纳米医学中的应用：对蛋白冠proteoform的准确表征分析

分享一篇发表在ACS Nano上的文章：Mass Spectrometry-Based Top-Down Proteomics in Nanomedicine: Proteoform-Specific Measurement of Protein Corona[1]，文章的通讯作者是密歇根州立大学的孙良亮教授。

纳米医学利用生物相容性的纳米颗粒（nanoparticles，NPs）进行治疗性分子的控制和/或靶向输送，以便将其送达所需的组织或器官，用于成像和疾病诊断。它的整体有效性受到蛋白质/生物分子冠的强烈影响。蛋白冠（protein corona）是指当NPs暴露于生物体液环境时，各种类型的生物分子（主要是蛋白质）会迅速在其表面结合，形成一层“蛋白冠”。研究表明蛋白冠可以决定NPs的生物学特性和药代动力学。此外，蛋白冠还能作为一种分析手段来发现疾病的生物标志物，这是因为其能简化生物体液样本的复杂性，使得生物标志物的检测和识别变得更容易。因此，全面表征蛋白冠的组成对于提高纳米药物的安全性，以及增强其治疗和诊断的有效性至关重要。

基于质谱的Bottom-up蛋白质组学策略被广泛运用于蛋白冠的表征，但该方法不能用于蛋白冠中proteoform的准确鉴定。已有文献报道，不同修饰产生的不同proteoform会显著影响蛋白与NPs的结合，以及影响蛋白冠的厚度，从而导致NPs与细胞间的相互作用发生变化。因此，准确鉴定蛋白冠中的proteoform将提供更准确的蛋白质冠图像，可以更好地理解蛋白冠如何指导NPs与细胞间的相互作用，为proteoform生物标志物的发现提供了机会。基于高分辨质谱的Top-down蛋白质组学可以对复杂生物样本中的完整蛋白进行直接分析，是表征proteoform的理想策略。

因此，作者在本工作中建立了一套基于质谱的Top-down蛋白质组学的分析流程，以用于蛋白冠proteoform的详细表征。作者首先使用聚苯乙烯纳米颗粒（PSNPs）和市售的健康人血浆样本来形成蛋白冠，然后使用含有SDS的洗脱缓冲液将蛋白冠从PSNP表面洗脱下来，将蛋白冠置换到与质谱兼容的缓冲液（100 mM碳酸铵，pH 8）中，最后是利用毛细管区电泳-质谱（CZE-MS）进行proteoform的分离和检测。这里使用的是Orbitrap Exploris 480质谱。对于分子量＜30kDa的proteoform，一级全扫描分辨率设为480,000；对于分子量＞30kDa的proteoform（high-high模式），一级全扫描分辨率则设为7500（low-high模式）。二级扫描分辨率均为120,000。TopPIC用于high-high模式下检测到的proteoform的鉴定和定量。而对于low-high模式，UniDec和ProSight Lite分别用于proteoform平均分子量的确定和鉴定。实验大致流程如图1所示。

图1. 对PSNPs样本，基于质谱的Top-down组学分析的流程示意图。

PSNPs与人血浆样本孵育后，会在PSNPs表面形成蛋白冠，它的颗粒尺寸也从78.9±0 nm增加至105.3±3.8 nm。与裸露的PSNPs颗粒尺寸分布的偏差相比，蛋白冠形成后的偏差是更大的的，这也说明单个PSNPs上的蛋白冠存在一定程度的异质性。图2A的透射电镜图分别是未结合蛋白的PSNPs、形成蛋白冠的PSNPs和蛋白冠洗脱后的PSNPs。与血浆孵育后，PSNPs表面明显被一层较暗的外壳所覆盖，表明形成了蛋白冠。经0.4%的SDS 溶液洗脱后，PSNPs上的蛋白质明显减少，表明该蛋白冠外壳可以被成功洗脱。为了评估Top-down方法的整体重复性，作者从PSNP和血浆孵育开始，平行准备了三个样本。洗脱后的蛋白冠经CZE-MS/MS分析，结果显示样品间的TIC图、proteoform的鉴定数和匹配谱图（PrSMs）数都非常一致（图2B）。此外，任意两个样本间的proteoform强度也展现出不错的相关性（r=0.88~0.93）（图2C）。图2D是proteoform（3-70 kDa）强度的热图，样本间的谱图相似，这也进一步说明本工作开发的Top-down蛋白质组学分析流程具有很高的定量重复性。

图2. 蛋白冠的表征。（A）透射电镜图：未结合蛋白的PSNPs、形成蛋白冠的PSNPs和蛋白冠洗脱后的PSNPs；（B）三个平行蛋白冠样本的TIC谱图；（C~D）平行样本间的proteoform强度的相关性和热图。

作者从三个样本中提取了三个大蛋白（~28、51和66 kDa）的提取离子流，它们的分离谱图和峰强度都在样本间都相对一致（图3A）。峰1的强度在不同样本间出现了明显变化，这可能因为在数据采集过程中的循环周期较长，导致峰顶区域的数据点不足所致。图3B是这三个蛋白对应的质谱图和去卷积质量。每个蛋白都检测到了多个proteoform。例如，66 kDa的蛋白有三个proteoform，质量分别为66,560 Da、66,872 Da（66,560 + 312 Da）和67,184 Da（66,560 + 312 + 312 Da），66,560 Da的proteoform丰度最大。根据二级和Bottom-up数据，作者推测该蛋白为人血清白蛋白（HAS）。与native状态的HSA相比（17个二硫键，理论分子量为66,438 Da），这里丰度最大的proteoform（66,560 Da），质量偏差了+122 Da，可能是发生了一个磷酸化（+80 Da）和一个乙酰化（+42 Da），或是发生了半胱胺化（+119 Da）。HSA的另外两种proteoform，很大可能是由于糖基化修饰引起的。同样，根据二级和Bottom-up数据，28 kDa的蛋白被鉴定为载脂蛋白A-I（APOA1），这里清晰检测到了它的五种proteoform。有趣的是，这五种proteoform，丰度由高到低，分子量在连续增加，并且相邻proteoform间的质量差均为266 Da，这可能是脂质化造成的。硬脂酸（十八酸，284 Da）的羧基与蛋白质的胺基发生反应，脱去一分子水，分子量刚好增加266 Da。这五种proteoform可能分别代表具有0~4个硬脂酸化位点的APOA1。先前一项Top-down的研究表明APOA1的proteoform与心血管代谢健康指标密切相关，这也表明对蛋白冠的Top-down质谱分析，可能为疾病生物标志物的发掘提供了一种强有力的技术策略。对于51 kDa的蛋白，共检测到了51,200 Da和51,860 Da这两种proteoform，但可惜的是，已有信息还不能实现对这两种proteoform的准确鉴定。

图3. 三种大分子量proteoform的检测分析。（A）三种proteoform的提取离子流图；（B）三种proteoform的质谱图和去卷积质量。

作者利用CZE-MS/MS对蛋白冠样本进行了Bottom-up（图4A）和Top-dwon（图4B）的蛋白组学分析。其中，Bottom-up的蛋白冠样本是直接在PSNPs上进行酶切制备的，而Top-down样本则是从PSNPs上洗脱下来后进行检测的。如图4A所示，在三个蛋白冠样本中都一致鉴定到了600张PrSMs、100个proteoform和20个proteoform家族（来自同一基因的一组proteoform），总共鉴定到了263个proteoform和50个proteoform家族。对于Bottom-up分析（图4B），在三个蛋白冠样本中都鉴定到了约8000张肽匹配谱图、3000条肽段和200个protein group（有共享肽段，蛋白序列相似），总共鉴定到了280个protein group和5606条肽段。虽然Top-dwon在蛋白质组覆盖率方面不及Bottom-up，但其在proteoform检测方面具有巨大的优势。血清淀粉样蛋白A-1（SAA1）是一种肾癌的预后标志物，通过CZE-MS/MS的Top-down分析，可以鉴定到18种proteoform。图4C展示的是SAA1的四种proteoform，它们具有不同的序列长度和翻译后修饰。Proteoform 1在N端带有一个乙酰化和463 Da的质量增加；Proteoform 2约有一个12 Da的质量增加，对应一个甲基化修饰；Proteoform 3有一个16 Da的质量增加，对应一个氧化修饰；Proteoform 4则不带任何修饰。此外，Top-dwon还可以获取每种proteoform的相对丰度信息。例如，从feature intensity可以看出，proteoform 1的丰度远低于其它两种proteoform。然而，SAA1在Bottom-up中所归属的protein group包含了五个蛋白质，它们都具有相似的氨基酸序列。这也说明了Bottom-up方法目前还无法由肽段准确推断至蛋白。

最后，为了进一步提高Top-down方法对proteoform及其家族的鉴定，实验发现1%的SDS洗脱与3小时的孵育更有利于蛋白冠的洗脱。在该洗脱条件下，作者比较了三种方法的proteoform鉴定情况：1）RPLC-MS/MS；）与之前一致的CZE-MS/MS；3）采用CZE-FAIMS（高场不对称波形离子迁移谱）-MS/MS。所有数据均在Orbitrap Exploris 480质谱的high-high模式下采集的。相比于先前0.4%的SDS洗脱（图4A），优化后的CZE-MS/MS可以鉴定到更多的proteoform及其家族， CZE-FAIMS-MS/MS比CZE-MS/MS多鉴定到了约40%的proteoform和64%的proteoform家族，而CZE-MS/MS与RPLC-MS/MS的鉴定数相似（图4D）。综合三个方法的数据，总共鉴定到了883个proteoform和73个proteoform家族，平均每个家族约有10个proteoform。虽然CZE-MS/MS与RPLC-MS/MS的鉴定数相当，但两者的proteoform重叠率比较低，表明两种方法在proteoform鉴定上有很好的互补性。由于CZE和RPLC分别是基于荷质比和极性进行蛋白质的分离，原理上的差异使得它们可以成为很好的正交分离技术，适用于复杂体系proteoform的鉴定。此外，CZE-MS/MS中只有不到40%的proteoform被CZE-FAIMS-MS/MS所覆盖，表明在FAIMS界面可能存在潜在的proteoform丢失。上述结果也表明单一的Top-down分析技术（CZE、CZE-FAIMS或RPLC）所能获取的proteoform信息是有限的，可以通过整合多种技术来实现proteoform更为全面的检测和表征。

图4. 蛋白冠样本Top-dwon和Bottom-up蛋白组学分析的比较。（A）Top-dwon方法鉴定到proteoform、PrSMs和proteoform家族的数目；（B）Bottom-up方法鉴定到的肽段、肽匹配谱图和protein group的数目；（C）SAA1在Top-dwon中鉴定到四种proteoform，以及其在Bottom-up中归属的protein group；（D~E）不同方法（RPLC、CZE和CZE-FAIMS）在蛋白冠中鉴定到的proteoform及其家族的数目。

总的来说，本工作展示了Top-down蛋白质组学方法在准确鉴定NPs蛋白冠上proteoform方面的潜力，这有助于预测它们在纳米医学中的行为和有效性至关重要，可以增强我们对NPs生物学意义的理解，改善NPs在医学中的应用。

撰稿：陈昌明

编辑：李惠琳

文章引用：Mass Spectrometry-Based Top-Down Proteomics in Nanomedicine: Proteoform-Specific Measurement of Protein Corona.