分享一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章，题目为“Chemoproteomic Profiling of Clickable Fumarate Probes for Target Identification and Mechanism of Action Studies”，通讯作者是来自美国Biogen公司的Douglas S. Johnson和Lu Zhang。这篇文章中作者设计了一种可点击探针用于富马酸酯的靶标鉴定和作用机制研究。

富马酸二甲酯（DMF）是针对多发性硬化症的一种成熟口服疗法，然而DMF具有广谱的体内反应性和复杂的药代动力学，其作用机制仍不清楚。DMF在生理条件下容易水解产生富马酸单甲酯（MMF），这两种富马酸酯会在蛋白质上的半胱氨酸残基上形成共价修饰，发挥调控功能。因此对DMF和MMF进行蛋白质组水平的靶标鉴定有助于明确DMF的治疗机制。

于是作者在DMF和MMF的结构中引入生物正交的炔基基团，合成了两种富马酸酯的可点击类似物探针DMF-yne和MMF-yne。使用探针对活细胞或细胞裂解液进行标记后，通过胶内荧光观察探针标记的蛋白质。结果显示两种探针都可以浓度依赖地标记蛋白质，并且这种标记可以被各自的母体化合物DMF和MMF所竞争。作者进一步将探针标记的蛋白与生物素偶联后使用链霉亲和素进行富集，利用Western Blot验证了探针可以对富马酸酯的已知靶标KEAP1进行共价修饰。

在验证了探针与母体化合物富马酸酯具有相似的反应性后，作者采用定量蛋白质组学方法对富马酸酯靶标进行全面分析。利用TMT-16plex，作者整合了探针浓度梯度和母体化合物竞争浓度梯度实验，获得了DMF_yne和MMF_yne探针特异性标记的定量靶标谱图。随后，作者通过Western Blot对质谱结果中两种探针的的共同靶标如GAPDH和DJ-1，以及两种探针的独特靶标如ALDH2和VDAC3等蛋白与探针的共价反应进行了验证。

最后，作者利用基于碘乙酰胺-脱硫生物素探针的TMT-ABPP实验，对细胞中DMF和MMF的半胱氨酸反应性进行了分析，鉴定富马酸酯敏感的半胱氨酸位点。将结果与基于富马酸酯探针的定量化学蛋白质组学结果进行比较，作者发现两种方法都能鉴定到很多独特的靶标，说明其开发的富马酸酯探针可以作为鉴定富马酸酯敏感靶标的很好的补充方法。

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总之，这篇文章中作者设计了一种可点击的富马酸酯探针，用于鉴定富马酸酯药物的共价修饰靶标。

本文作者：LCX

责任编辑：LZ

DOI：10.1021/acschembio.4c00617

原文链接：https://doi.org/10.1021/acschembio.4c00617