ACS Chem. Biol. | 使用生物正交化学的可逆 RNA 酰化实现 CRISPR-Cas9 核酸酶活性的时间控制

分享一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章：Reversible RNA Acylation Using Bio-Orthogonal Chemistry Enables Temporal Control of CRISPR-Cas9 Nuclease Activity，通讯作者是纽约州立大学奥尔巴尼分校化学系的Maksim Royzen教授，他的课题组研究方向包括RNA研究工具、顺磁性NMR探针和生物正交化学。在这篇文章中，作者开发了一种基于生物正交化学可逆地控制CRISPR-Cas9系统活性的方法。

CRISPR-Cas9系统是一种广泛采用的基因组编辑工具，利用sgRNA指导Cas9靶向基因组中的特定DNA序列，产生双链断裂。目前，人们感兴趣于开发调节CRISPR-Cas9活性的策略，用于减少长时间的脱靶效应，以及在发育生物学领域在动物发育的特定阶段研究感兴趣的基因。然而目前开发的调控方法都需要进行大量复杂的生物工程设计。

因此作者设计了一种利用此前报道的断键生物正交化学反应控制CRISPR-Cas9活性的方法。首先利用反式环辛烯-酰基咪唑试剂（TCO-Im）与RNA反应，将TCO基团随机引入RNA的2’-OH上，随后通过1,2,4,5-四嗪-3,6-二甲胺（Tz）处理，经过逆电子需求Diels-Alder环加成和分子内环化两步反应的断键生物正交化学对RNA进行脱笼。这个体系的优势在于TCO和Tz两种试剂是无毒的，并兼容多种生物应用。

为了进行概念验证，作者首先利用18-nt RNA寡核苷酸模型测试TCO基团的引入和去除反应条件，确定了TCO-Im处理可以向RNA上引入多个TCO基团，并可以在Tz处理后脱除。

随后作者希望测试这一方法能否控制CRISPR-Cas9系统的活性。于是作者将sgRNA进行TCO修饰，并通过体外实验测试这一修饰对sgRNA指导Cas9靶向线性化eGFP-N1质粒切割能力的影响。结果显示TCO-Im处理可以完全消除核酸酶的切割活性，而Tz处理可以使CRISPR-Cas9活性得到一定的恢复。

最后作者将这一策略应用在细胞体系之中，对表达GFP的HEK293T细胞进行sgRNA和编码Cas9的mRNA的共转染。结果显示，转染TCO封闭的sgRNA对细胞GFP表达水平的扰动很小，而Tz处理后GFP表达水平产生了明显降低。说明TCO封闭和Tz释放能够实现CRISPR-Cas9系统活性的掩蔽和重新激活。

本文作者：LCX

责任编辑：ZF

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.4c00117

文章引用：10.1021/acschembio.4c00117