分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，本文的标题为“Near-Infrared Bioluminescence Assays for Protein−Protein Interactions and Cellular Membrane Fusion in Deep Tissues Using Split Akaluc Reconstitution”，本文的通讯作者为东京大学的Takeaki Ozawa教授，课题组的研究方向为生物分子成像和蛋白质互作分析方法的开发。

基于荧光素酶催化荧光素的生物发光成像在活体中具有独特的优势，其无需外部激发，能够实现高信噪比的实时监测。然而，现有生物发光系统（如萤火虫荧光素酶 Fluc和NanoLuc）在深层组织成像方面存在局限性，如信号穿透力低、背景噪声高等。为此，本文报道了一种基于近红外发光酶Akaluc的酶裂片互补技术，通过计算机模拟和实验筛选确定了最佳拆分位点，分别融合感兴趣的蛋白，当蛋白在发生相互作用发生时恢复荧光素酶的催化发光能力，从而提高信号灵敏度和组织穿透能力。

首先，为了明确Akaluc最佳的切割位点，作者依据Fluc的结构设计构建了一个Akaluc片段文库，并使用雷帕霉素诱导FK506 结合蛋白（FKBP）和FKBP结合域（FRB）相互作用，根据发光强度和结合前后发光相对变化幅度进行了筛选，最终选择了N410/C392作为最佳切割位点。

随后，作者在体外和体内分别验证了该策略对GPCR/β-Arrestin 互作的可行性。体外实验选取FPR1-β-Arrestin 1和ADRB2-β-Arrestin 2作为模型，以评估Akaluc系统对 GPCR/β-Arrestin 相互作用时间模式的检测能力。作者将AkalucN 与 β-Arrestin融合，AkalucC与GPCRs融合，并在GPCR与AkalucC之间引入柔性短肽 (GGGGS)4以恢复其立体结构。cAMP水平和发光强度变化显示，配体诱导的GPCR/β-Arrestin互作使两段Akaluc片段接近并恢复生物发光活性。同时作者还检测了Akaluc系统的灵敏度，并发现在HEK293细胞中，1 nM配体浓度就能诱导明显的发光信号。此外作者还捕捉到不同GPCR/β-Arrestin结合模式的时序差异，展现了其在GPCR信号研究中的应用潜力。

在体内实验中，作者比较Akaluc和Fluc系统，发现GPCR/β-arrestin 交互作用仅能导致Akaluc裂片的互补并发出能够穿透深层组织的近红外光。通过同时注射竞争性抑制剂prop和配体iso，发光强度被显著抑制，说明生物发光信号的特异性。

由于Akaluc片段表现出高效的重构特异性，作者分别开发了两种包含Akaluc片段的细胞系，利用Akaluc系统检测肌细胞融合过程。通过将分别表达AkalucN和AkalucC片段（分别称为N探针和C探针）的细胞系引入小鼠C2C12肌细胞中，当肌细胞发生融合时，N探针和C探针自发相互作用，并通过蛋白质剪切反应共价重构为功能性Akaluc，从而产生生物发光。最后，作者将Akaluc系统应用至活体小鼠中，并成功观测到与体外实验一致的肌细胞融合事件。

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最后，作者将Akaluc系统应用至活体小鼠中，并成功观测到与体外实验一致的肌细胞融合事件。

总的来说，本文开发了一种Akaluc裂片重构方法，并验证其作为检测深层组织细胞事件的有效工具。

本文作者：CJJ

责任编辑：WYQ

DOI：10.1021/acs.analchem.4c06986

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06986