分享一篇2024年发表在Analytical Chemistry上的文章，Taylor−Aris Dispersion-Assisted Mass Spectrometry for the Analysis of Native Proteins1。该文章的通讯作者是来自德国德布勒森大学无机与分析化学系的Attila Gaspar教授。
非变性质谱技术是揭示蛋白质及其复合物天然结构的重要工具，它能够提供关于蛋白质组成、化学计量比、亚基排列以及与配体结合位点的详细信息。为了保持蛋白质的天然构象，通常在pH值约为7的缓冲溶液中进行电喷雾离子化（ESI）。然而，常用的缓冲体系，如PBS和Tri-HCl，含有大量非挥发性盐分，这些盐分会干扰蛋白质的离子化过程，抑制其信号强度。为了在质谱分析中同时保持蛋白质的天然状态并减少基质干扰，研究人员探索了多种策略。一种常见的方法是通过超滤或在线脱盐技术，将样品转移到醋酸铵缓冲液中。但这些处理过程可能会改变蛋白质的原始特性，因此，需要尽可能缩短样品处理时间。一种简便的方法是在样品中添加大量醋酸铵，以中和钠盐引起的信号抑制，或者使用特定试剂在ESI过程中实现脱盐。此外，还可以采用直径为0.5 μm的纳米喷针，通过产生更小的初始液滴来降低单位液滴中的盐分与蛋白质的比例。
本文介绍了一种创新的质谱分析技术—Taylor−Aris扩散辅助质谱（TADA-MS），该技术通过利用蛋白质与基质成分（如盐分）在扩散系数上的显著差异，实现了在不破坏蛋白质天然构象的前提下，直接从复杂基质中分析蛋白质。本研究中，研究者们选用了多种蛋白质样品，包括治疗性抗体、肌红蛋白、血红蛋白和Concanavalin A等，以验证TADA-MS技术的有效性。如图1所示，通过TADA-MS技术，研究者们能够直接从药物的配方缓冲液中分析治疗性抗体Ramucirumab。在毛细管内的层流状态下，大分子抗体（＞150 kDa）与小分子盐分实现了分离，其中抗体主要集中在流束的前部和尾部。前部的质谱（图1a）信号清晰且易于评估，表明该区域含有纯度较高的单克隆抗体。而在中间部分，由于样品基质（盐、缓冲化合物和洗涤剂）造成的强干扰，如离子抑制和多种加合离子的形成，并未观察到抗体信号（图1c）。流束的尾部也显示出清晰的质谱信号（图1d），因此推断前后区域的纯度水平接近。此外，在此次TADA-MS测量中观察到的单体（26+~31+）和二聚体（37+~45+）的带电状态与Heck和Van Den Heuvel基于蛋白质的折叠状态和带电残基机制计算的理论带电状态（单体为29.9+，二聚体为42.3+）非常一致，说明分析的整个过程都保持了抗体的原始构象。对ramucirumab的TADA-MS分析使得在原生条件下，无需任何的预处理，就能确定完整单克隆抗体（mAbs）的分子质量，并且还能够清晰地观察到糖基化模式。去卷积谱中的主要峰值分别出现在146595.0、146754.4、146916.7和147078.7 Da，分别对应于G0F/G1F、G1F/G1F或G0F/G2F、G2F/G1F、G2F/G2F糖型。
图1天然TADA-MS测定Cyramza (含10 mg/mL雷莫芦单抗)
此外，作者还展示了TADA-MS技术在分析其他不同类型蛋白质和蛋白质复合物时的应用。在分析血红蛋白复合物时，TADA-MS技术同样表现出了其在非变性条件下分析蛋白质的能力，能够检测到与血红素结合的蛋白质复合物holo-Hb, αH（图2c）以及蛋白质的寡聚体形式-α2β2, αβ (图2d)。此外，对比了Concanavalin A在变性直接注入和TADA-MS分析获得的MS1谱图，如图3a-b所示，变性条件下（1 M FA）可观察到单体、二聚体和水解的蛋白亚基片段（蛋白质成熟过程中形成），而在天然条件下则能观察到额外的四聚体信号，这因为四聚体的形成需要两个去质子化的组氨酸残基(pH值应高于6)。Con A与碳水化合物结合依赖于Ca2+和Mn2+离子，这些离子稳定了蛋白质的结构。由于二聚体和四聚体的宽峰(由加合物形成引起)和单体获得的低强度，与蛋白质相结合的金属离子的存在不能在MS1谱图中得到证明（图3a-b）。通过在源内裂解低聚物的方式，观察到了单体Con A及其两种水解产物，产生了更多的电荷态和更高的信号强度，从而能够鉴定与该蛋白相关的Ca2+-Mg2+和Ca2+-Mn2+离子（图3d）。这些结果表明，TADA-MS技术在非变性质谱分析中具有显著优势，能够提供关于蛋白质或蛋白质复合物的详细信息，包括分子质量、糖基化模式以及蛋白质复合物的组装状态，而无需复杂的样品预处理步骤。
图2 天然TADA-MS测定血红蛋白
图3 比较变性直接进样和天然TADA-MS分析Concanavalin A
总之，TADA-MS分析具有以下优势：1）灵敏度提升：TADA-MS能够显著降低基质干扰，灵敏度提高超过25倍。2）天然环境：该方法允许在接近生理条件下进行分析，使用PBS等缓冲液保持蛋白质的天然状态。3）流程简单：无需进行预处理或缓冲液交换，节省了时间和成本。TADA-MS为天然蛋白质的分析提供了一种高效、灵敏且简化的解决方案。该技术的应用前景广阔，尤其是在制药行业中，能够加速生物制剂的开发和质量控制。未来的研究可以进一步探索TADA-MS在其他生物分子分析中的潜力。
撰稿：刘蕊洁
编辑：李惠琳
原文：Taylor−Aris Dispersion-Assisted Mass Spectrometry for the Analysis of Native Proteins
