分享一篇发表在JACS上的文章，文章标题“A Bioorthogonal Precision Tool for Human N-Acetylglucosaminyltransferase V”，文章的通讯作者是来自伦敦帝国理工学院和弗朗西斯·克里克研究所的Benjamin Schumann，课题组致力开发聚糖的“精密工具”来研究人类细胞的糖基化。
人类细胞分泌途径中N-连接聚糖的正确合成在生理学中至关重要。早期的N-聚糖生物合成遵循装配线原理，然后经历关键的加工点，其特征是糖N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）的顺序掺入。GlcNAc转移酶V（MGAT5）的活性为N-聚糖天线的生物合成奠定了基础，然而MGAT5的功能相关性和底物选择还不明确。本文设想通过“凸凹互补（bump-and-hole，BH）”策略开发适用于MGAT5生物正交报告工具：用较小的氨基酸取代大的疏水残基来工程化酶(（Hole），为生物正交UDP-GlcNAc类似物（Bump）创造空间（图1B）。
图1. MGAT5 bump-and-hole原理
作者选定9个含有不同功能酰胺侧链的UDP-GlcNAc衍生物（图2A），其中类似物3，5，7，8可用磷酰胺化学合成（图2B），其他类似物首先用NahK催化磷酸化，之后用AGX1突变体催化合成UDP糖的合成（图2C）。
接下来，作者使用普鲁卡因酰胺(PA)标记的NGA2作为受体底物评估了工程化的MGAT5变体是否能够接受合成的UDP糖底物。结果显示：WT-MGAT5显示出显着的底物混杂性: 不同的UDP-GlcNAc类似物都有程度不同的转化率（图3A）。然而，作者发现MGAT5变体对UDP-GlcNAc类似物6(UDP-GlcNButAz)的接受具有明确的选择性，动力学参数仅仅比WT-MGAT5/UDP-GlcNAc对低2至3倍（图3B）。在竞争实验中，发现BH-MGAT5更偏好UDP-GlcNButAz，而WT-MGAT5更偏好天然底物UDP-GlcNAc（图3C）。
之后作者评估BH-MGAT5是否选择性地将UDP-GlcNButAz结合到合适的糖蛋白受体底物中。作者使用Β-半乳糖苷酶处理无唾液酸胎球蛋白重塑位NGA2结构（asialo-agalactofetuin）作为MGAT5受体底物，将该asialo-agalactofetuin与BH-MGAT5/UDP-GlcNButAz以及增加浓度的UDP-GlcNAc一起温育，在铜催化的叠氮炔环加成(CuAAC)条件和链霉亲和素印迹下用生物素炔处理来评估BH-MGAT5活性，同时也在缺乏内在的MGAT5活性的Lec4中国仓鼠卵巢(CHO)细胞变体中观察到相同的实验结果（图4A）。作者进一步用质谱表征了化学修饰的N-聚糖，通过用含炔烃的永久正电荷咪唑标签(ITag)处理追踪GlcNButAz掺入（图4B，C）。这些结果说明BH-MGAT5选择性地将GlcNButAz引入糖蛋白底物，并允许通过MS追踪新形成的聚糖连接。
最后，作者解析了BH-MGAT5/UDP-GlcNButAz的结构，解析BH突变如何定位在活性位点，同时氨基酸侧链所占的空间大大缩小，并保持了亲本相似的空间轨迹，扩大了活性位点（图5）。
综上所述，本文基于MGAT5结构基础开发一个生物正交底物类似物的活性MGAT5变体，通过化学酶合成一系列的生物正交UDP-GlcNAc类似物。
文章作者：WCJ
原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c05955
责任编辑：LD
