分享一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，题目为Template-assisted covalent modification underlies activity of covalent molecular glues。本文共3位通讯作者，分别为斯坦福大学药学院的Nathanael S. Gray教授、哈佛大学药学院的Eric S. Fischer教授，以及哈佛大学药学院的Benjamin L. Ebert教授。Gray课题组从事癌症治疗工具的开发，Fischer课题组针对泛素化修饰的分子机制进行研究，Ebert课题组主要研究血液恶性肿瘤的分子基础和治疗。
分子胶是一种能够诱导蛋白邻近的小分子，目前已成为一种极具吸引力的治疗策略。与PROTACs等双功能分子相比，分子胶具有更小的分子尺寸以及更好的成药性，因此更有利于临床开发。尽管有这些优势，迄今为止只有少数泛素连接酶已有特异性的分子胶降解剂。
本文中，作者揭示了一种新型共价分子胶的作用机制，并将其称为“模板辅助共价修饰”。在此前研究中，研究人员基于溴结构域（Bromodomain，BD）的广泛抑制剂 JQ1，报道了一种可降解 BRD4的衍生物GNE-0011（GNE11）。在本文中，作者首先证实GNE11能够特异性诱导含BRD4第二溴结构域（BRD4BD2）的蛋白底物降解，在16h的最大降解深度约为50%。
通过合成一系列 GNE11 结构类似物，作者发现了一种丙烯醛类似物TMX1能更有效地降解 BRD4。当使用TMX1处理K562细胞后，基于质谱的蛋白质组学分析表明，BRD4 是主要的降解靶标，而非共价抑制剂JQ1处理不会改变上述蛋白的丰度。同时，作者发现TMX1和GNE11诱导的 BRD4 降解被泛素蛋白酶体通路的多种抑制剂所阻断，证实降解过程基于泛素介导的机制。
为寻找具体的泛素连接酶，作者通过CRISPR筛选的策略，以BRD4的稳定性变化为指标，对潜在的基因进行敲除。同时，作者过表达BRD4BD2-Flag蛋白，在使用TMX1后进行IP-MS分析，寻找小分子介导的PPI。上述分析均筛选得到DCAF16，证实TMX1和GNE11通过RBX1-CUL4-DDB1-DCAF16 (CRL4DCAF16) 体系降解BRD4。
接下来，作者基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术，在体外重构BRD4BD2与DCAF16-DDB1复合物之间的相互作用。TMX1和GNE11均能诱导明显的相互作用，但是在高于5 μM的TMX1处理时，相互作用的强度反而发生了下降，即表现出钩状效应。作者推测TMX1和GNE11中存在的亲电反应基团造成了上述现象，因此对分子胶与BRD4BD2、DCAF16-DDB1的共价反应性进行了评估。在单独孵育TMX1与DCAF16–DDB1时，DCAF16的修饰率为8%；若在体系中加入BRD4BD2，则DCAF16的修饰率达到50%。GNE11也表现出类似的现象，证实三元复合物的存在促进了分子胶对DCAF16的有效标记。
接下来，作者进一步筛选了共价反应基团，并获得了具有更强效的分子胶MMH1和MMH2。为证实共价反应性在上述分子胶中的重要性，研究人员获得了MMH1-NR与MMH2-NR，发现其完全丧失了对诱导形成三元复合物并降解BRD4的能力。
作者解析了MMH2处理后DB1ΔB–DDA1–DCAF16复合物的结构，发现MMH2与DCAF16的C58残基共价连接。作者对DCAF16进行丙氨酸突变扫描，并比较突变对TMX1或此前报道的PROTAC分子KB02-JQ1降解能力的影响。结果表明，C58残基仅对TMX1的讲解效果具有重大影响。对于C58S突变体，TMX1不再能够对DCAF16产生共价修饰，且丧失了诱导形成三元复合物并降解BRD4的能力。
作者同样对BRD4BD2结构域进行了丙氨酸突变扫描，寻找TMX1具有BD1与BD2之间选择性的分子机制。除了已知的JQ1结合残基，H437A对TMX1的降解活性也表现出重要贡献。对比BD1与BD2在结合JQ1后的结构，作者注意到最大的结构差异出现在含有H437的loop结构处。对该处结构进行突变，BD2不再被TMX1降解，而模仿BD2的突变可使得BD1能够被TM1所降解。
综上所述，本文基于非共价的JQ1抑制剂，发现了“模板辅助共价修饰”的分子胶机制，并发展了一系列针对BRD4BD2的分子胶降解剂。
本文作者：TZS
责任编辑：ZJ
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-024-01668-4
原文DOI：10.1038/s41589-024-01668-4
