分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，题目为“Dual-Locked Enzyme-Activatable Bioorthogonal Fluorescence Turn-On Imaging of Senescent Cancer Cells”。文章的通讯作者为南洋理工大学的Kanyi Pu教授。

生物正交化学作为一种新兴的方法，不仅可以操纵生物分子来理解生物学基础，还可以用于开发疾病诊疗的靶向工具。目前这种方法多应用于分子成像，首先将具有生物正交手柄的靶向剂掺入生命系统中，通过代谢标记或亲和相互作用结合目标生物分子，再引入具有互补生物正交手柄的探针成像。这种靶向成像方法优化了靶向试剂在疾病部位的积累和清除，从而改善了探针的传递，缩短了成像时间。由于大多数成像探针都具有“始终开启”的信号，它们在非特定位置也会积累，因此在成像过程中会受到广泛的背景信号的干扰（图1a-i）。分子光学成像提供了一种非侵入性、动态和实时的方法来检测生物标志物，用于疾病监测和治疗评估。与“始终开启”的光学探针相比，具有信号开启的生物正交荧光成像探针具有更高的信噪比（图1a-ii）。生物正交荧光开启成像的最常见方法依赖于四嗪的固有淬灭特性，淬灭通常需要荧光基团和四嗪之间的光谱重叠或分子轨道对齐，因此适用的荧光基团数量有限：另一种方法是利用生物正交手柄将荧光团笼住，分子内电荷转移（ICT）受到抑制，在生物正交反应时键断裂打开荧光团，使得ICT激活重新开启荧光。这三种生物正交荧光开启成像方法已被用于可视化和分析生命系统中的各种物质。然而，生物正交手柄的可点击性是“始终开启”的，上述方法在非特异性位置也会导致荧光开启。因此需要设计具有可激活点击性的生物正交靶向剂，目前的方法主要集中在利用光开启双正交手柄的可点击性（图1a-iii）。

图1. 生物正交靶向用于光学成像的设计。

细胞衰老的特征是细胞永久性的增殖停滞，在生物系统中执行双功能。即在癌症的背景下，细胞衰老主要可以通过限制癌细胞增殖来抑制肿瘤进展，然而，过多的衰老癌细胞可能会导致持续的炎症状况，又会有利于癌细胞的发展。因此，有必要对衰老癌细胞进行特异性监测，以评估衰老诱导癌症治疗的治疗效果，提供适当的支持性治疗，同时避免因治疗剂量过大而引起的副作用。目前细胞衰老得检测方法主要通过组织化学染色或活检肿瘤切片来检测衰老相关的生物标志物，例如β-半乳糖苷酶（β-Gal）。β-Gal是衰老的一般生物标志物，通常在衰老细胞或组织中表达，所以这些方法缺乏对衰老细胞类型的检测特异性。因此，基于生物标志物开发一种能检测区分衰老癌细胞和正常衰老细胞的成像探针具有重要意义。

基于此，作者提出了双锁-酶激活生物正交荧光探针开启成像的方法（DEBOF），以评估癌症治疗效果（图 1b）。该方法包括双锁生物正交靶向剂（DBTA）和生物正交激活荧光成像探针（BAP）（图 2a）。DBTA 是一种四嗪衍生物，偶联被动肿瘤靶向部分（PVP）。衰老细胞标志物β-Gal和癌细胞标志物γ-谷氨酰基转移酶（GGT）的可酶切基团拢住模块中四嗪，使四嗪的可点击性只有在同时有癌症和衰老生物标志物存在的情况下才会被特异性触发，否则不会被触发正交反应（Clickability-OFF）。BAP 是一种反式环辛烷（TCO）笼状半菁衍生物，与亲水性长聚乙二醇链（PEG）连接，由于缺乏ICT，最初荧光被淬灭。在将BAP用于活体小鼠后，DBTA的四嗪与BAP的TCO之间发生逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）反应，BAP的释放，导致荧光开启。这种双锁-酶激活的正交荧光开启成像方法可以无创监测活体小鼠中衰老癌细胞的波动（图2b）。

图2. 双锁–酶激活生物正交荧光开启成像的设计与机制。

首先作者基于小分子双锁四嗪（DL-Tz）的合成和PVP偶联进行了DBTA的合成（图 3a）。由于PVP的存在，DBTA无法从HPLC柱中洗脱出来，为了验证靶向试剂的双酶激活活性，使用DBTA前体DL-Tz进行高效液相色谱（HPLC）分析。DL-Tz 分别与β-Gal、GGT和β-Gal + GGT混合孵育。只有β-Gal + GGT一起孵育才产生原有四嗪的洗脱峰（HPLC保留时间= 16.7分钟），DL-Tz与两种生物标志物单独孵育时则未观察到原有四嗪的洗脱峰（图3b）。HPLC分析显示，切割具有有先后顺序，首先快速切割DL-Tz的GGT部分，其次是β-Gal部分（图3c）。双酶裂解在4 h内完成，得到生物正交反应性四嗪（Clickability-On）（图3d,e）。

图3.双锁响应预靶向基团的合成及体外表征。

接下来，作者合成并研究了生物正交激活近红外探针BAP，其由一个近红外荧光染料ICysOH和淬灭基团TCO组成，并在尾部引入了一段聚乙二醇长链，增加探针的溶解性。紫外-可见光谱和荧光发射光谱表明，BAP最初在600和650 nm处有两个吸收峰，但是无法检测到荧光。与四嗪反应后，BAP的吸收在730nm处急剧增加（图4a），同时BAP的近红外荧光（NIRF）在770 nm处增加17.6倍（图4b）。说明当Tz与TCO发生生物正交反应后BAP被剪切，ICysOH的荧光能够被有效激活，HPLC也同样证实。BAP与Tz反应后，生成的产物峰与PEG-ICysOH一致（图4c）。作者推测BAP的活化机理如下：与四嗪反应后，BAP变成4,5-二氢哒嗪中间体（4,5-DHP），然后互变异构形成1,4-二氢哒嗪中间体（1,4-DHP）。在自发的1,4-消除和环化之后，形成活化的BAP作为最终产物（图4d）。这些结果证实了四嗪对BAP的NIRF 激活。

图4. 近红外荧光探针BAP的合成及体外表征。

为了验证DEBOF成像对癌症和衰老相关生物标志物的检测能力，将BAP和DBTA混合在PBS中分别与β-Gal、GGT和β-Gal + GGT孵育，观察孵育前后的光学变化。仅在与β-Gal + GGT孵育后，观察到660 nm处的吸收增加，并在770 nm处出现新的荧光峰（图5a,b）。HPLC也同样证实了BAP和DBTA与β-Gal + GGT共孵育生成的产物峰下与活化的BAP洗脱峰一致（HPLC保留时间= 10.1分钟）（图5c）。为了验证这种方法对衰老癌细胞的成像能力，用阿霉素（Dox）处理4T1乳腺癌细胞以诱导衰老，没有GGT内源性表达的3T3成纤维细胞视为阴性非癌对照，用DBTA和BAP顺序孵育以进行成像（图5c,d）。与DBTA和BAP孵育后，在Dox处理的4T1细胞中检测到最高的平均荧光强度（MFI），分别是未处理的4T1细胞、未处理的3T3成纤维细胞和Dox处理的3T3成纤维细胞的4.48倍、6.66倍和4.30倍（图5e,f）。Dox处理的4T1细胞用β-Gal抑制剂（D-Gal）和GGT抑制剂（GGsTop）处理时，未观察到荧光信号（图5e）。Dox 处理后4T1细胞的高信号增强与其 β-Gal 的高免疫荧光增强密切相关（图 5g）。NIRF信号与溶酶体的免疫荧光共定位良好，Pearson系数高达0.96，表明溶酶体中存在主要的信号开启（图5h）。这些结果证实了DEBOF对衰老癌细胞成像的高选择性。

图5. 生物正交荧光探针DBTA和BAP对衰老癌细胞的特异性检测能力表征。

最后，作者将4T1荷瘤小鼠分为三组，研究了DEBOF对衰老癌细胞的体内和离体成像能力。一组使用生理盐水作为阴性对照，一组使用Dox治疗，一组在Dox外添加Navitoclax（图6a）。Navitoclax是一种抗衰老剂，可选择性地消除衰老细胞并抑制肿瘤生长。药物治疗后，将DBTA静脉注射到活小鼠体内，靶向衰老癌细胞。2 h后，静脉注射BAP，然后进行NIRF成像。仅在Dox处理小鼠观察到荧光信号，注射BAP后36 h信号强度达到最大值（图6b,c）。此外，在Dox处理的小鼠中，离体NIRF主要位于肿瘤中。这些结果表明BAP在Dox处理的小鼠肿瘤中具有特异性激活。为验证信号与衰老癌细胞群的相关性，对3种治疗方案下的肿瘤切片进行免疫荧光染色，研究癌症治疗后癌症相关生物标志物（GGT）和衰老相关生物标志物（β-Gal）的表达水平，然后对生物标志物的免疫荧光与活化BAP的离体NIRF进行线性回归相关性分析。离体NIRF（红色信号）与β-Gal（黄色信号）和GGT（绿色信号）的免疫荧光很好地共定位（图6d）。在Dox处理的小鼠中检测到最高的NIRF。离体NIRF与β-Gal和GGT的免疫荧光具有很强的线性相关性（图6e,f）。通过将肿瘤大小与体内 NIRF 相关联，证明了这种成像方法监测衰老诱导癌症治疗的治疗结果的能力。在药物处理后观察到小鼠体重的轻微变化（图6g），与生理盐水和Dox处理组相比，Dox和Nav的组合显着抑制了肿瘤生长（图6h）。这些结果表明，这种成像方法能够监测由癌症治疗引起的细胞衰老波动，并为癌症治疗评估提供预后信息。

图6. 4T1肿瘤中治疗诱导衰老的体内和离体NIRF 成像介导肿瘤治疗。

综上所述，作者开发了一种双锁-酶激活生物正交荧光开启成像方法（DEBOF），用于衰老癌细胞的无创检测。该方法利用基于四嗪的双锁定生物正交靶向剂（DBTA）和TCO笼式生物正交可激活成像探针（BAP）。凭借双锁设计，DBTA仅在同时存在癌症相关生物标志物和衰老相关生物标志物的情况下才具有生物正交点击性，进一步与BAP反应，原位开启BAP的NIRF。本研究不仅为提高光学成像方法的选择性提供了新的途径，而且为推进生物正交化学在分子光学成像领域的应用提供了新的途径。DEBOF开启成像在细胞水平上的高成像特异性和灵敏度允许精确识别疾病中改变的细胞状态，有利于疾病识别和治疗评估。双锁-酶激活双正交化学也可用于设计智能给药系统，通过位点特异性酶切割实现药物在所需位置精确释放，从而减少药物全身副作用，提高治疗准确性。