J. Am. Chem. Soc. | 能够诱导胞外蛋白降解和跨血脑屏障的双向胞穿嵌合体

介绍的是最近在Journal of the American Chemical Society 上报道的一篇标题为 “Bifunctional Molecules That Induce Both Targeted Degradation and Transcytosis of Extracellular Proteins in Brain Cells” 的文章。该文的通讯作者是耶鲁大学的David A. Spiegel教授。本文开发了一种基于血脑屏障转运多肽Angiopep-2的新双功能分子，叫做TransMoDEs (Transcytosis-inducing molecular degraders of extracellular proteins)，能够有效地通过溶酶体过程降解靶蛋白并实现跨脑内皮细胞的蛋白质靶标的内吞作用。

靶向蛋白质降解已经在近些年成为了一种极具潜力的治疗方式，承担此任务的多种异双功能分子主要利用细胞自身的途径来降解，可以快速地清除一些异常积累的蛋白质。这种方法的一个潜在应用场景是神经相关疾病的治疗，因为许多神经系统疾病与致病蛋白的积累有关，而这些物种的去除被认为可以减缓疾病的进展。然而，受限于传统PROTAC分子的降解机制，目前在各种神经疾病中有疗效的研究实例仅限于Tau蛋白。除此之外，还有许多细胞分泌蛋白也对这些疾病的进展有重要作用，清除这些分子可能也具有神经疾病的疗效。

在治疗这些疾病时，血脑屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)是人们不得不考虑的要素之一，它能在在很大程度上限制药物进入脑组织而影响疗效。Angiopep-2是一种靶向脑部组织的多肽，衍生于Kunitz蛋白酶的抑制结构域。当被共价偶联到一种治疗药物上时，Angiopep-2能够成功地将小分子、抗体和纳米颗粒靶向到大脑组织。因此，在本文中，作者团队基于Angiopep-2开发了一种多功能嵌合体分子，能够跨BBB靶向到脑组织中，实现神经细胞上的分泌蛋白靶标的内吞和降解。 (图1)

图1. 基于Angiopep-2的跨血脑屏障多功能降解嵌合物示意图。

首先，他们根据Angiopep-2的分子结构，在其N端，10号位和15号位的K的三个氨基上进行小分子配体修饰，以形成双功能嵌合体。将三个氨基分别进行乙酰化(对照修饰)、Biotin修饰(以与链霉亲和素结合)和卤代烃修饰(以与含Halotag的蛋白结合)，分别命名为TransMoDE 2-6。选出TransMoDE 3在脑上皮细胞bEnd.3和星形胶质细胞C8D1A中验证其是否能引起链霉亲和素-AF647的内吞。流式细胞术分析细胞的荧光强度证实了这一点。且在6小时、1 μM的条件下能引起较好的内吞，且没有观察到Hook效应。(图2)

图2. 在Angiopep-2的氨基上修饰以获得几种TransMoDE，并观察到TransMoDE 3能够在时间和浓度依赖的条件下促进链霉亲和素-AF647的内吞。

接下来，作者用Western Blot进一步表征了细胞对链霉亲和素-AF488的摄取和降解。在经由TransMoDE处理后，细胞培养液中人为添加的链霉亲和素-AF488显著降低，表明TransMoDE 3引发了其内吞。在细胞裂解液中，出现了一条分子量约23 kD的条带，且会随着TransMoDE 3处理的时间增加而增多，作者团队推测这是由于链霉亲和素的降解所引起的条带变化。(图3)

图3. 通过Western Blot验证TransMoDE促进的链霉亲和素内吞和随后发生的降解。

接下来，作者团队探究了TransMoDE 3降解链霉亲和素的下游转运情况和机理。共聚焦显微镜显示，AF647标记的链霉亲和素与溶酶体标记物LAMP1在细胞中有着好的共定位，溶酶体抑制剂能够抑制其降解也证明了TransMoDE 3通过溶酶体途径介导胞外蛋白的降解。并且，当加入高浓度生物素与TransMoDE 3竞争时，细胞对链霉亲和素的摄取出现了一定程度的降低。而用低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(LRP1，被认为是与Angiopep-2有相互作用的蛋白)竞争时，则没有出现细胞摄取的降低，而且细胞对于链霉亲和素-AF647的降解不依赖于细胞表面LRP1蛋白的表达量，这表明其降解不依赖于LRP1的相互作用。(图4)

图4. TransMoDE发挥降解功能的机制研究。

此外，作者团队用一个体外模型模拟血脑屏障，以证明TransMoDE的降解作用能跨过血脑屏障。他们将bEnd.3细胞在一个多孔膜上单层培养，并观察到了葡萄糖转运的抑制，这证明此模型能够部分模拟血脑屏障的功能。从屏障的任意一侧添加链霉亲和素都可以使细胞成功摄取并降解。而另一些仅能与MoDE结合却无法通过血脑屏障的配体则不能实现bEnd.3细胞的摄取。证明了基于Angiopep-2的双功能分子可以跨越血脑屏障，从而降解脑部的靶标蛋白。 (图5)

图5. TransMoDE 3能够在模拟血脑屏障的环境下实现脑组织中链霉亲和素的降解。

综上所述，本文基于一种能够跨越血脑屏障的配体多肽Angiopep-2开发了能够降解脑部组织细胞外蛋白的多功能嵌合体。能够在脑部上皮细胞和星形胶质细胞中引起细胞外的链霉亲和素被内吞随后降解。尽管此过程并不依赖Angiopep-2的传统受体LRP1，但仍然能够通过溶酶体途径而内吞和降解胞外蛋白，并能够在辅助跨越血脑屏障的过程中发挥重要作用。

作者：DYH 审校：SYM

DOI: 10.1021/jacs.3c13320

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c13320