文章分享的是一篇发表在“Chemical Science”上的文章，这篇文章探讨了一些化合物对于硫醇介导摄取的抑制作用。文章的通讯作者是瑞士日内瓦大学Stefan Matile教授。
硫醇介导摄取是一种通过转运蛋白介导的细胞内物质转运方式，可用于治疗一些疾病。然而，硫醇介导摄取的效率受到限制，因此需要寻找新的方法来控制其效率。
研究人员在实验中发现，一些化合物可以抑制硫醇介导摄取的效率，从而控制细胞内物质的转运。这些化合物可以作为硫醇介导摄取的抑制剂使用。
该机制的关键步骤是底物二硫化物与细胞表面外表面硫醇之间的动态共价硫醇-二硫化物交换（图1）。然后，共价结合的底物通过融合、内吞作用或直接跨质膜转运进入细胞质进入细胞。
图1 在硫醇介导的摄取中，与细胞表面硫醇的动态共价交换先于通过不同机制进入。因此，通过去除外表面硫醇和二硫化物来抑制硫醇介导的摄取可以提供新的抗病毒药物。
作者研究了底物（如药物、探针）以及较大物体（如蛋白质或具有细胞穿透性聚（二硫化物）的量子点）的细胞溶质递送。最近的重点转移到环状低聚硫属元素化物 (COC)，以提高动态共价硫醇-低聚硫属元素化物交换的速度和选择性，最重要的是，确保可逆性，即摄取过程中的流动性，具有共价连接的分子内离去基团。
荧光标记的 COCs1和2因其高活性、它们在胞质溶胶中的目的地以及它们的不同特征而被选为筛选硫醇介导的摄取抑制剂的报告基因（图2）。1中的 COC是桥二硫二酮哌嗪 (ETP)。在 CSSC二面角∼0°的情况下，ETP 将环张力推向极致。开环硫醇-二硫化物交换超快，释放的硫醇酸性足以在中性水中继续交换，包括闭环。这种独特的交换化学与有效的细胞摄取和硫醇亲和柱上的保留不佳相吻合。
图 2 记者1和2以及候选抑制剂3-30的结构，其浓度需要抑制 ~15% (MIC) 1的摄取（与抑制剂预孵育 1 h，与记者孵育 30 min，填充符号）和2（4 小时预孵育，空符号）。红色方块：ETP；橙色圆圈：BPS；蓝色向上三角形：杂芳族砜；紫色钻石：硫代磺酸盐；洋红色向下三角形：二硫化物和多硫化物；棕色六边形：硫代亚磺酸盐。带向上箭头的符号：未达到测试的最高浓度的 MIC。带向下箭头的符号表示测试的最低浓度已经超过 MIC。(a) 在记者和抑制剂共同孵化时同样活跃；(b-d) 类似地 (b)、更少 (c) 或更多 (d) 在存在血清的情况下共同孵育（主要是 6 h）；(e) 预孵育 15 min；(f) 异构化为顺式22；(g) V 形 DRC（见图 3f); (h) 预孵育 30 分钟，与2共同孵育；(i) 区域异构体的混合物。
以 COCs1和2作为细胞穿透报告基因，开发了一种全自动、基于荧光显微镜图像的高内涵高通量 (HCHT)多孔板中的 HeLa 细胞与恒定的报告基因和不同浓度和孵育时间的抑制剂一起孵育。受阻的报告基因摄取随后导致细胞内荧光的减少（图 3a）。建立了自动数据分析以提取每个细胞的平均荧光强度，同时从碘化丙啶阴性核计数中提取细胞活力（图 3) 。标准测定条件包括将HeLa细胞与抑制剂预孵育不同时间段，然后去除抑制剂并添加报告基因，从而排除两者在细胞外环境中可能发生的相互作用。在替代的共孵育条件下，在添加记者之前没有去除抑制剂，以允许两者之间的最终相互作用。
图 3 (a) HCHT 板（每孔 4 张图像）的荧光图像，其中 HeLa 细胞与6 （30 min）预孵育，然后与1（左）和2（右，各 10 μM）共孵育 30 min。(b–f) HCHT 数据显示 HeLa 细胞在 (b) 与4预孵育 1 小时，然后洗涤并与1（顶部）孵育后的相对荧光强度（实心符号）和细胞活力（空心符号），或与4预孵育30 min，然后与4和2 （底部）共同孵育。(c) 与 (b) 中的18相同。(d) 如 (b) 所示，用16孵育 4 h后随后与2孵育。(e) 如 (b) 所示，在与11（圆圈）、14（十字）或21（菱形）预孵育 15 min后，洗涤并与1孵育。(f) 如 (b) 所示，在与20（30 分钟）预孵育后，随后洗涤并与1孵育。
抑制剂按照对报告基因1 的效率顺序编号，通过它们的最小抑制浓度 (MIC) 进行评估，即导致细胞中报告基因摄取减少约 15% 的浓度(图 2）。选择使用 MIC(图 3b- f），并不总是能达到半数最大抑制)。MIC通常低于半数最大细胞生长抑制浓度（GI50,）。
ETP 报告基因1最有效的抑制剂是 ETP 4和5（图2、3b)。这种有趣的自我抑制甚至被扩展的环状四硫化物ETP4, 3(MIC<0.1 μM)超越，这是令人感兴趣的，因为它们是更差的转运体。10进一步的正式扩环导致环状五硫化物 BPS 5 6作为同样出色的抑制剂(MIC≈0.3μM)。这种适应网络的趋势，让人想起元素硫化学，并没有延伸到无机多硫化物13(MIC≈20μM)。ETP 4和5对羧酸盐的修饰敏感，阳离子12最差（MIC≈30μM)，中性葡萄糖半缩醛7最有希望（MIC ≈ 0.5μM）。尽管这项研究侧重于越来越极端的动态共价COC化学，但包含一个共价C-S 键形成的例子是为了进行比较。经典的碘乙酰胺7和马来酰亚胺4 的毒性大于活性（未显示）。然而，杂芳族砜的亲核芳族取代，20刚刚开发用于硫醇高效生物正交转化为硫化物，更有前途。与动态共价 COC 相比，这种不可逆抑制作用在苯并恶唑11（MIC ≈15μM)时效果最好，并且根据对游离硫醇对恶二唑14和苯并噻唑21的反应性（MIC≈300μM,图 3e)而降低).
在恒定 pH 值下，Ellman 试剂20在该测定中也被证实是不稳定的。DRC 显示出高达约 2 mM 的轻微抑制，其在更高浓度下再次消失(图 3f)。其他环状二硫化物也没有活性(28–30)。
报道分子2比1更难抑制，正如在硫醇亲和柱上的高活性和极端保留所预期的那样。BPS6对ETP1非常有效，但对BPS2的活性要低得多（图3a），尽管较长的预孵育可将MIC降低至4μM（图2,)。互补的ETP4“自我抑制”ETP1，但也不能有效抑制 BPS 2（图3b）。BPS 2的最佳抑制剂之一共孵育后是二硫键桥接的γ转角肽18和19（MIC≈5μM），两者对1 的活性较低（MIC≈300μM，图3c)。二硫键桥接的γ转角 CXC 肽由具有显着 Prelog 应变的 11 元环组成。Wu 和同事介绍了它们作为有效细胞溶质递送的转运体。环状硫代磺酸盐15和16显示出针对1和2的有前途的活性，并且对血清的存在具有耐受性（图 2d,)。与硫代亚磺酸盐相反27, 硫辛酸氧化成纯硫代磺酸盐到目前为止还没有成功。然而，与无活性的硫代亚磺酸盐27相比，氧化为硫代亚磺酸盐的硫辛酰-谷氨酸结合物的微弱可检测活性（MIC≈350μM，未显示）暗示硫辛酸氧化为硫代磺酸盐的活性也低于谷氨酸结合物15。
与抑制剂预孵育后去除抑制剂并与报告基因1或2孵育以进行检测的标准方案相比，共孵育方案与抑制剂预孵育后与报告基因1或2共同孵育，无需抑制剂去除，给出了相当相似的结果（图 2).抑制特性自然取决于预孵育时间，较短和较长时间的活性较弱，分别反映不完全交换和细胞反应或其他抑制剂破坏方式。血清的存在对活性也没有太大影响（图 2b-d）。
从这项研究中，硫醇介导的摄取可以被硫醇反应试剂有效抑制，证实存在硫醇介导的摄取，并且像 ETP1和BPS 2这样的转运蛋白不会简单地扩散到细胞中；最好的抑制剂比Ellman 试剂好5000多倍。其次，抑制剂效率因转运蛋白而异，支持硫醇介导的摄取作为复杂的多目标系统运行。最好的抑制剂是通过快速动态共价交换起作用的COC，这表明 COC 提供的可逆性很重要。
总之，该文章对于硫醇介导摄取的研究具有一定的参考价值，可以为开发新的治疗方法提供一些思路。
原文链接：https://doi.org/10.1039/D0SC05447J
