糖类作为细胞的主要组分之一，在许多生理过程中发挥着重要的作用。在病理状态下，细胞表面的糖类会发生结构或表达的变化，因此可作为一种重要的标志物用于疾病的诊断。清华大学化学系林金明教授团队与国家纳米科学研究中心林玲博士合作，开展细胞膜表面聚糖相关的研究(Anal. Chem., 2019, 91, 2600)。该团队在之前的工作中，利用核酸标记和扩增技术，通过凝集素与糖类的特异性结合，实现了MALDI-TOF质谱对于细胞表面糖类的原位、多组分分析（Chem. Sci., 2016, 7, 5448）。最近的研究表明，相比于膜表面全部的聚糖，某些特定蛋白上的聚糖在调节膜受体功能和指示细胞生理病理状态中起到了更加关键作用。为了深入了解糖基化调节机制，针对活细胞特定蛋白上的聚糖成像研究变得十分重要。
目前已有的成像方法主要是利用荧光共振能量转移的原理在蛋白和聚糖上分别标记供受体对。对于蛋白的标记通常是利用基因编码的策略以产生荧光融合蛋白或插入结合序列。然而，这种方法要求目标蛋白的末端必须位于细胞膜外用以连接荧光标签。此外，序列的插入可能会破坏蛋白结构的完整性从而影响功能的发挥。为避免以上问题，在国家自然科学基金（No. 21435002, 21727814）资助下，该合作团队提出一种非基因编码的标记策略，利用受体配体结合的方式将荧光供体锚定到特定蛋白上，通过糖代谢/生物正交的反应将荧光受体安装到膜表面聚糖上。同时，目标糖蛋白上的标记配体可被其他无标记的化合物灵活地竞争，从而有效地擦除供体荧光信号。该策略将有可能通过多次循环（标记的配体结合，FRET诱导的荧光成像和未标记的化合物竞争导致荧光擦除）来实现对膜表面不同蛋白上的聚糖依次成像。
该团队以白细胞介素-36受体（IL-36R）为例，研究了其上聚糖的表达。IL-36R是白细胞介素-1受体超家族的成员，与炎症相关疾病紧密相关。其上具有8个细胞外结构域上的N-连接糖基化位点，并发现糖基化在调节受体功能中起重要作用。但目前尚未实现在活细胞上对IL-36R上的聚糖进行原位成像。通过分别在细胞膜表面聚糖上标记Alexa Fluor 647荧光受体基团（通过糖代谢和生物正交反应）和在IL-36R上标记Alexa Fluor 488荧光供体基团（通过配体受体结合），利用荧光共振能量转移的原理，可特异性成像特定蛋白上的聚糖。
进一步考虑到细胞膜上聚糖的多样性和复杂性，在给定的活细胞上成像多种受体聚糖是非常重要的。然而，由于很难找到无干扰的单激发多发射的FRET对，因此多种聚糖同时成像受到了极大地阻碍。该团队设想可以通过使用未标记的化合物与标记的配体竞争并擦除原始供体信号，然后依次用相同的FRET对成像另一种受体上的聚糖来有效地避免这种障碍。为验证这个设想，在细胞表面IL-36R受体结合了标记的配体IL-36γ-Fluor 488之后（KD = 1800±200 nM），引入具有更强结合亲和力的未标记拮抗剂IL-36Ra（KD = 5.8±0.3 nM）去与IL-36γ-Fluor 488竞争，20分钟后大部分的供体荧光信号被擦除。作者同时提供了竞争配体浓度与共振能量转移效率的曲线图。这些数据表明通过适当浓度的无标记竞争配体可灵活地擦除荧光信号。因此，该策略可通过多次循环（标记的配体结合，FRET诱导的荧光成像和未标记的化合物竞争导致荧光擦除）来实现对细胞膜表面不同蛋白上的聚糖依次成像。这一原位聚糖分析策略有望在分子诊断和细胞靶向治疗中具有广泛的应用。
该研究论文第一作者为清华大学化学系博士生李楠同学，博士后张炜飞博士为共同第一作者。
