利用Fmoc固相合成策略, Wang树脂为载体, 合成了3条[4 Trt+2 Acm]保护的利那洛肽线性前体化合物(图 1).

图1 三条[4 Trt+2 Acm]保护的利那洛肽线性前体化合物 Figure1. Three linear precursors of linaclotide containing [4 Trt+2 Acm] groups

1.1.1   一步氧化形成两对二硫键

将多肽树脂放入反应瓶中裂解, 乙醚沉淀得到粗肽, 粗肽分离纯化后进行质谱检测, a ([M+H]⁺＝1674.8, [M+Na]⁺＝1696.8, [M+K]⁺＝1712.8), b ([M+H]⁺＝1674.9, [M+Na]⁺＝1696.9, [M+K]⁺＝1712.9), c ([M+H]⁺＝1674.7, [M+Na]⁺＝1696.7, [M+K]⁺＝1712.7), 利那洛肽[4 SH+2 Acm]的线性前体肽理论分子量为1673.5, 证明得到的多肽结构为[4 SH+2 Acm].使用氯化血红素催化氧化的方法分别氧化a、b、c, 其中a、b氧化可以得到一个主产物a-1、b-1, 由于c的氧化产物过于复杂(图 2), 没有对其分离及进行下一步反应.分别对a-1、b-1进行分离纯化, 质谱检测a-1 ([M+Na]⁺＝1692.4, [M+K]⁺＝1708.4), b-1 ([M+ H]⁺＝1670.5, [M+Na]⁺＝1692.5, [M+K]⁺＝1708.4), 证明其结构为[2 S-S+2 Acm].

图2 三条[4 Trt+2 Acm]利那洛肽的线性前体肽脱除Trt保护后一步氧化形成两对二硫键HPLC分析 Figure2. After removing Trt from [4 Trt+2 Acm] linear precursors of three linaclotides were oxidized to form two disulfide bonds (A) a [4 SH(2, 5, 10, 13)+2 Acm(1, 6)], (B) b [4 SH(1, 5, 6, 13)+2 Acm(2, 10)], (C) c [4 SH(1, 2, 5, 10)+2 Acm(5, 13)]

1.1.2   氧化形成第三对二硫键

在下一步脱除Acm保护基形成二硫键的反应中, 我们首先尝试了I₂氧化脱除的方法, 但与文献报道一样, 都没有得到目标产物.如前体肽a-1 [2 S-S(2-10, 5-13)+2 Acm(1, 6)], 只含有一对Acm保护基, 理论上脱Acm后HPLC分析应该为一个单峰, 但滴加I₂氧化后却生成了三个产物, 且都不是目标多肽.随后我们采用了PhS(O)Ph/CH₃SiCl₃氧化的方法, 将上面得到的a-1溶于TFA中, 加入过量的CH₃SiCl₃和PhS(O)Ph搅拌反应20 min, 加入乙醚和4 mol/L的醋酸震荡, 取水相与a-1、利那洛肽标准品共同进样HPLC分析.从色谱图上看, a-1反应完全, 几乎定量得到单一的产物a-2, a-2的色谱行为与标准品一致(图 3).将a-2分离纯化后进行质谱检测, a-2 ([M+H]⁺＝1526.6, [M+Na]⁺＝1548.6, [M+ K]⁺＝1564.6), 利那洛肽的理论分子量为1525.4, 与理论值相符, 可以证明a-2为利那洛肽, 同时也证明了a-1中的两对二硫键连接方式为Cys2-Cys10, Cys5-Cys13.

图3 a-1 [2 S-S(2-10, 5-13)+2 Acm(1, 6)]采用PhS(O)Ph/ CH₃SiCl₃体系氧化后HPLC分析(*为杂质峰) Figure3. HPLC analysis of a-1 [2 S-S(2-10, 5-13)+2 Acm(1, 6)] after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃) (A) a-1 after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃), (B) mixture of A and a-1, (C) mixture of A and standard linaclotide (S). The peak * (retention time at 14.5 min) LCMS observed [M+H]⁺＝247

在其它条件不变情况下, 将a-1与PhS(O)Ph、CH₃SiCl₃反应的时间延长至30 min, HPLC分析结果相同, 说明反应没有二硫键重排现象发生^[14], PhS(O)Ph/ CH₃SiCl₃氧化的方法可以用于脱除利那洛肽的线性前体肽中半胱氨酸的Acm保护基, 并氧化形成二硫键.

然而, 在使用相同的方法脱除b-1上半胱氨酸的Acm保护基时, HPLC分析发现b-1与PhS(O)Ph/ CH₃SiCl₃几乎不反应, 我们在开始尝试用I₂脱除b-1中的Acm保护基时也发现存在同样的现象.说明b-1中的两对二硫键形成的特定空间结构, 大大降低了Cys2和Cys10之间相互接触发生反应的几率, 使其不能顺利脱除Acm保护基而形成二硫键.

1.2   合成3条利那洛肽前体化合物[2 Trt+4 Acm]

使用第1.1节中相同的方法合成了3条[2 Trt+4 Acm]保护的利那洛肽线性前体化合物(图 4).

图4 三条[2 Trt+4 Acm]保护的利那洛肽线性前体化合物 Figure4. Three linear precursors of linaclotide containing [2 Trt+4 Acm] groups

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