合成了3条[2 Trt+4 Acm]保护的利那洛肽线性前体化合物(图 4).

图4 三条[2 Trt+4 Acm]保护的利那洛肽线性前体化合物 Figure4. Three linear precursors of linaclotide containing [2 Trt+4 Acm] groups

图5 三条[2 Trt+4 Acm]利那洛肽的线性前体肽脱除Trt保护后氧化形成第一对二硫键HPLC分析 Figure5. After removing Trt from [2 Trt+4 Acm] linear precursors of linaclotide, were oxidized to form one disulfide bond (A) d [2 SH(1, 6)+4 Acm(2, 5, 10, 13)], (B) e [2 SH(2, 10)+4 Acm(1, 5, 6, 13)], (C) f [2 SH(5, 13)+4 Acm(1, 2, 6, 10)]

1.2.1   氧化形成第一对二硫键

使用第1.1.1节中的相同方法裂解树脂, 得到含自由巯基的利那洛肽线性前体肽d、e、f, 质谱检测d ([M+H]⁺＝1816.9, [M+Na]⁺＝1839.0, [M+K]⁺＝1855.0), e ([M+Na]⁺＝1838.6, [M+K]⁺＝1854.6), f ([M+H]⁺＝1816.7, [M+Na]⁺＝1838.7, [M+K]⁺＝1854.7), 利那洛肽[2 SH+4 Acm]的线性前体肽理论分子量为1815.5, 证明制得的多肽结构为[2 SH+4 Acm].在下一步使用氯化血红素催化氧化形成二硫键时, 由于d、e、f只含有一对自由的巯基, HPLC分析几乎都得到了唯一的产物: d-1、e-1、f-1, 分别将其进行分离纯化进行质谱分析, d-1 ([M+H]⁺＝1813.4, [M+Na]⁺＝1836.6, [M+K]⁺＝1852.5), e-1 ([M+H]⁺＝1814.7, [M+Na]⁺＝1836.6, [M+K]⁺＝1852.6), f-1 ([M+Na]⁺＝1836.7, [M+K]⁺＝1852.7), 证明其结构为[1 S-S+4 Acm].

1.2.2   一步氧化形成剩余两对二硫键

使用(PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃)方法一步氧化d-1、e-1、f-1, 加乙醚、醋酸震荡后取水相进行HPLC分析, 发现d-1氧化得到两个主产物d-2、d-3, 色谱峰面积比为57: 43(图 6, A); e-1氧化产物复杂, 没有明显的主产物; f-1氧化得到一个主产物f-2(图 7, A).

图6 d-1 [1 S-S(1, 6)+4 Acm(2, 5, 10, 13)]采用(PhS(O)Ph)/ (CH₃SiCl₃)体系氧化后HPLC分析(*为杂质峰) Figure6. HPLC analysis of d-1 [2 S-S(1, 6)+4 Acm(2, 5, 10, 13)] after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃)(A) d-1 after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH₃SiCl₃), (B) mixture of A and d-1, (C) mixture of A and standard linaclotide(S). The peak* (retention time at 14.5 min) LCMS observed [M+H]⁺＝247

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图7 f-1 [1 S-S(5, 13)+4 Acm(1, 2, 6, 10)]采用PhS(O)Ph/ CH₃SiCl₃体系一步氧化后HPLC分析(*为杂质峰) Figure7. HPLC analysis of (A) f-1 [1 S-S(5, 13)+4 Acm (1, 2, 6, 10)] after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH3SiCl3) f-1 after treatment of (PhS(O)Ph)/(CH3SiCl3), (B) mixture of A and f-1, (C) mixture of A and standard linaclotide (S). The peak* (retention time at 14.5 min) LCMS observed [M+H]⁺＝247

将d-1氧化反应的水相与d-1、利那洛肽标准品共进样HPLC分析, 发现d-3的色谱行为与标准品一致(图 6, B、C), 将d-2, d-3分离纯化后进行质谱检测, d-2 ([M+H]⁺＝1526.5, [M+Na]⁺＝1548.6, [M+K]⁺＝1564.5), d-3 ([M+H]⁺＝1526.5, [M+Na]⁺＝1548.5, [M+K]⁺＝1564.4) 都与利那洛肽的理论分子量相符, 证明d-2为利那洛肽的二硫键错配异构体, d-3为利那洛肽.

将f-1氧化反应的水相与f-1、利那洛肽标准品共同进样HPLC分析, 发现f-2的色谱行为与标准品一致(图 7, B、C), 将f-2分离纯化后质谱检测, f-2 ([M+H]⁺＝1526.5, [M+Na]⁺＝1548.5, [M+K]⁺＝1564.5) 与利那洛肽的理论分子量相符, 证明f-2为利那洛肽.