硼替佐米 (PS-341) 1 (Fig. 1) 是第一个进入临床的蛋白酶体抑制剂,由Millennium制药公司研发,2003年上市,商品名为万珂®,被美国批准用于治疗复发性多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。硼替佐米是26S蛋白酶体的可逆性抑制剂,26S蛋白酶体是一种ATP依赖的2.4 MDa多催化作用的蛋白质,位于真核细胞的细胞核和细胞质中,可以降解大量通过泛素途径标记的蛋白质和多肽,参与细胞内稳态和细胞周期调控。硼替佐米中的硼原子能结合26S蛋白酶体的催化位点,抑制蛋白酶体活性,阻断蛋白质水解,从而干扰信号传导,导致细胞死亡。
Figure 1. 硼替佐米的结构
硼替佐米实质是以三聚硼酸酐2的形式存在。在药物冻干的制备过程中,硼氧烷2与辅料甘露醇形成二酯,而该酯在注射用生理盐水溶液中可以重新释放出药物,得到活性硼酸1。
经反合成分析可知,硼替佐米分子由三个结构单元组成:吡嗪酰基、L-苯丙氨酰基和L-硼亮氨酸,它们通过肽键连接在一起。Scheme 1概述了硼替佐米的合成方法,应用手性化合物 (1S,2S,3R,5S)-蒎烷二醇酯合成L-硼亮氨酸单元的对映体。硼酸酯3经CH2Cl2和LDA反应生成的LiCHCl2进行烷基化,生成鎓盐4,该鎓盐在ZnCl2作用下发生选择性重排,生成(1S,2S,3R,5S)-蒎烷二醇 (R)-1-氯-3-甲基丁烷-1-硼酸酯5。这种转化是合成手性α-取代硼酸酯的一种高效方法,称为Matteson重排。下一步在LiHMDS的作用下,中间体5的Cl与LiHMDS的氨基基团进行交换,发生亲核取代反应,同时立体中心反转。如果氨基没有质子化、酰基化或其它衍生化,则α-氨基硼化合物容易自发重排。在TFA作用下,氨基基团被转化为相应的三氟乙酸铵6,TFA重结晶后,以TBTU为缩合剂,手性铵盐6与N-Boc-L-苯丙氨酸缩合,得到Boc保护的二肽7,HCl脱Boc保护得到盐8。后者与吡嗪羧酸缩合,形成硼替佐米的蒎烷二醇酯9。最后,在正己烷和甲醇水的两相溶液中,在强酸性条件下,化合物9与异丁基硼酸发生酯交换,除去和再生蒎烷二醇手性部分,浓缩碱化的有机溶液,重结晶后分离得到硼替佐米的三聚酸酐形式2。
Scheme 1. 硼替佐米的合成
尽管总收率很高(纯物质的38 %),但合成工艺在合成顺序和基团保护方面还存在一点缺点,增加了反应步数,使整个反应过程变得复杂。在许多情况下,通过合理设计可以部分或完全忽略基团保护,这在复杂分子的合成和规模化生产中尤为有效。为开发一种简便高效的硼替佐米合成方法,设计了一种合成目标化合物的新方法。N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸10和氨基硼酸酯盐4是合成硼替佐米的关键中间体。这两部分进行缩合的潜在困难在于手性N-酰基氨基酸在羧酸活化后容易发生消旋化。为探讨缩合反应中不发生消旋的可行性,先制备两种关键中间体。
吡嗪羧酸与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐在DPPA作用下发生缩合反应,生成N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸甲酯,TLC进行纯化。将甲酯转化为羧酸10需要额外的水解步骤和分离过程,这促使寻找一个可替代的方法。将L-苯丙氨酸与N,O-双(三甲基硅基)-乙酰胺(BSA)进行简单的N,O-双硅烷化反应,随后用吡嗪羧酸和CDI制备的吡嗪酰基咪唑进行酰化,得到中间体10 (Scheme 2)。在此过程中,羧基以三甲基硅基酯的形式进行硅烷化保护,而苯丙氨酸中保护的硅烷化氨基对酰化剂仍有活性。此外,将两性离子形式的氨基酸转化为可溶于CH2Cl2的衍生物,使反应在均相中进行。经水处理可分离得到纯的产物,且收率较高。
Scheme 2. 硼替佐米的缩合反应
在制备另一关键中间体手性铵盐6时,发现即使重结晶也很难获得合适的纯度,则改进实验方法,将化合物5与LiHMDS反应制得双(三甲基硅基)氨基衍生物11,可经萃取分离纯化。化合物11的1H和11BNMR谱证实,甲基硅烷基团在水中不受影响。在惰性气体保护下,用TFA进行温和酸解,可得到纯盐6,无需额外纯化即可利用。
在CDI作用下,将铵盐6与羧酸10在30 ℃进行缩合,经非手性正相HPLC色谱鉴别,得到45:55的非对映体的混合产物。显然,N-酰基氨基酸10的立体中心在羧基活化后几乎完全消旋。该过程可能是通过噁唑酮中间体进行的,且在极性溶剂和吸电子的N-酰基基团(如吡嗪酰基)时更容易发生(Scheme 3)。
Scheme 3. 经过噁唑酮的消旋机理
实验操作
(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎烷二醇 (R)-1-双(三甲基硅基)氨基-3-甲基丁烷-1-硼酸酯 (11)
将n-丁基锂的正己烷溶液(1.6 M,132 mL)于-40 ℃搅拌下加入到六甲基二硅氮烷(41.1 g,255 mmol)的乙醚溶液(160 mL)中,搅拌10 min后,在-25 ~ -30℃间,加入(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎烷二醇 (S)-1-氯-3-甲基丁烷-1-硼酸酯5 (53 g,129 mmol) 的乙醚溶液 (180 mL),45 min加完,反应温度在1 h内升至0 ℃。冰水洗涤反应混合物,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩得油状物,35℃真空干燥 (~1×10-2 mmHg)得化合物11(62.98 g,87 %)。
(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎二醇 1-铵-3-甲基丁烷-1-硼酸三氟乙酸酯 (6)
双(三甲基硅基)胺11 (10.00 g, 62 mmol)溶于乙醚(90 mL)中,将此乙醚溶液于-15 ~ -10℃在氩气下加入搅拌的三氟乙酸(7.5 mL, 98 mmol)乙醚溶液(100 mL)中,1h内加完。混合液继续搅拌1.5 h,析出沉淀,过滤,乙醚洗涤(50 mL),35℃真空干燥,得到7.2 g白色结晶盐6 (78 %),mp 197-198 ℃。该产品在氩气保护下存放在于冰箱中,待下一步使用。
N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸 (10)
将BSA(50.7 g, 250 mmol)加入到L-苯丙氨酸(20.5 g, 125 mmol)的CH2Cl2(200 mL)悬浮液中,得到N,O-双(三甲基硅基)-L-苯丙氨酸溶液,室温搅拌过夜。
吡嗪羧酸(24.0 g, 194 mmol)溶于CH2Cl2(400 mL)形成混悬液,搅拌下将CDI(26.5 g, 250 mmol)加入到此混悬液中,得到吡嗪酰基咪唑溶液,室温搅拌过夜,冷至-30 ~ -40 ℃,然后在30 min内滴加N,O-双(三甲基硅基)-L-苯丙氨酸溶液。在2 h内将温度升至20 ℃,继续搅拌17 h。反应液用柠檬酸水溶液(一水合柠檬酸60 g溶于400 mL水)洗涤,分出水层用CH2Cl2 (100 mL)洗涤,合并有机层,加入乙醚(200 mL)稀释,无水硫酸钠干燥。35 ℃减压蒸去溶剂,得到黄色粉末3.1 g (97 %),mp 142-146 ℃。
(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎烷二醇 N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸-L-硼亮氨酸 (9)
将铵盐6(7.1 g, 18.7 mmol),N-吡嗪酰基-L-苯丙氨酸10(5.08 g,18.7 mmol)和TBTU(6.62 g, 20.6 mmol)加入CH2Cl2(75 mL)中形成混悬液,搅拌下冷却至-5 ℃。将DIEA(9.5 mL)的CH2Cl2 (35 mL)溶液在2 h内滴加入搅拌的反应混合物中,维持反应温度在-10 ~ -5 ℃。继续搅拌1.5 h,缓慢加热至室温。减压除去溶剂,残余物溶于乙酸乙酯(110 mL)中,依次用水(75 mL),3 %碳酸钾水溶液(50 mL×3),水(75 mL),3 %柠檬酸水溶液(50 mL×3),水(75mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥,减压蒸去溶剂,残余物溶于乙醚(50 mL),用硅胶过滤(乙醚100 mL洗涤)过滤,减压蒸去乙醚得到粘稠的油状物8.14 g (84 %),静置,慢慢结晶,mp 58 -59.5 ℃。
硼替佐米 (2)
硼酸酯9(68 g,13.12 mmol)溶于甲醇 (0.5 L),搅拌下加入正己烷(0.5 L)和1 N HCl(290 mL),两相混合物冷却至10 ℃。加入异丁基硼酸(24 g, 235 mmol),室温搅拌17 h。分离漏斗分离,甲醇层用正己烷(0.1 L×3)洗涤,合并的正己烷溶液浓缩至干。从残留的油状硼酸酯3中经色谱再生得到(1S, 2S, 3R, 5S)-蒎烷二醇手性助剂。甲醇水溶液用NaHCO3(30 g)中和,再用乙酸乙酯(0.85 L)提取,无水硫酸钠干燥,硅胶过滤,乙酸乙酯重结晶两次,得到白色无定形固体26.55 g(26.3 mmol, 60 %),纯度99.83 %(HPLC)。