氨氧基脂质的设计、合成及体外转染试验

氨氧基脂质的设计、合成及体外转染试验

摘要：为了找到一种结构简单的氨氧基辅助脂质，且能很好地适配阳离子脂质体达到高效转染目标基因的目的，本文用三缩四乙二醇、胆固醇氯甲酸酯和N- 叔丁氧羰基氨氧基乙酸等经济易得的原料，合成出一种新的氨氧基脂质APCL。它是一个两端分别为氨氧基和胆固醇甲酰基，并以一条连接链连接的两亲性脂质分子。将APCL 同阳离子脂质和其他辅助脂质通过薄膜分配法制成脂质体，并包裹报道基因，以另一种目前常用的氨氧基脂质CA 为对照进行试验，相同条件下的体外转染数据显示，APCL 阳离子脂质体运载系统比CA 体系的体外转染活性更高，平均转染活性提高了3 ～ 5 倍。

关键词：阳离子脂质体；氨氧基脂质；纳米微粒；体外转染

以下为文章节选

阳离子脂质体系统是迄今为止最有效的非病毒载体，已广泛用于小干扰RNA( siRNA) 的体外和体内运载[1—11]。尽管在使用脂质体运载siRNA 方面已有很多重大进展，但体内运载过程中仍存在几个严重的缺陷，大量试验表明该技术在体内运用效果不佳。一般而言，当存在于生物流体中时阳离子脂质体倾向于聚集和过早清除。可行的解决方法是将聚乙二醇(PEG) 聚合物作为一个水合层加入到阳离子脂质体体系中，即脂质体PEG 化。PEG 在脂质体复合物表面提供了空间屏障，既可防止和血浆蛋白非特异性结合，又可避免被网状内皮系统清除，从而增加脂质体的循环时间[12]。此外，PEG还可增加脂质体的溶解度，从而使其在较高治疗剂量时不易聚集[13]。目前，脂质体运载siRNA 的相关研究重点便是找到一种方法使大分子PEG 与阳离子脂质体连接，在血液运输中对脂质体复合物起到保护作用，而又不影响siRNA 在细胞内的有效释放[14]。

研究发现，将氨氧基脂质作为辅助脂质加入到阳离子脂质体体系中，再通过耦合反应，让氨氧基脂质分子中的氨氧基和聚乙二醇二丁醛中的醛基反应形成肟键，便可将大分子PEG 包裹在阳离子脂质体外，起到保护作用[15]。不同于其他的利用PEG延长长脂质体循环的研究，该文中报道的脂质体与PEG 大分子的连接是基于pH 触发机制：在pH 4 时，氨氧基和醛基偶联形成肟化物，之后再调回至pH 7，所形成的肟键在这种环境中便能稳定存在。当体系到达靶细胞中，内吞囊泡的内部空泡在内吞作用后6 h 的时间内酸化(pH 7 至pH 5.8)[16]，这时肟键便会被慢慢代谢分解，从而使包裹在内的微粒全部裸露出来，更好地释放出siRNA。在F1 小鼠中进行丙型肝炎病毒感染模型和在Sprague-Dawley 大鼠中进行的四氯化碳促使的急性肝损伤模型的体内研究结果表明，这种新剂型能将siRNA 和shRNA 构建体成功地功能性运载到肝脏并有效沉默靶基因，而其关键在于找到一个能很好地适配于阳离子脂质体的氨氧基脂质分子。

目前实验中常用的氨氧基辅助脂质为胆甾醇氨氧基脂质(cholesteryl aminooxy lipid，CA，图1)，但其水溶性不好，与阳离子脂质体的适配性不高，体外转染效果不理想[17]。为了解决上述问题，本研究通过合理的结构和路线设计，以价廉易得且低毒的三缩四乙二醇(1)、胆固醇氯甲酸酯(A) 和N-叔丁氧羰基氨氧基乙酸(C) 为原料，成功合成一种新的与PEG 连接的氨氧基脂质aminooxy PEG175 cholesteryl lipid(APCL，图1，为便于保存，合成时将其制成盐酸盐)。将其和阳离子脂质(DOTAP)及中性辅助脂质(DOPE) 通过薄膜分散- 超声法制成脂质体制剂，并包裹荧光素酶报道基因后，以HepG2 细胞株为靶标，检测出在相同条件下APCL参与的阳离子脂质体体系的转染效率远高于脂质CA 体系( 平均为3 ～ 5 倍)。且测量的其他参数，如粒径大小(size)、zeta 电位( ζ) 和聚合物分散性指数(PDI) 数据也表明，APCL 作为一种辅助脂质可以和阳离子脂质及其他辅助脂质形成均一、稳定且安全的脂质体纳米微粒运载体。

1 试剂及仪器

2 试验方法及结果

2.1 APCL 盐酸盐的化学合成

A 和乙二胺反应生成N- 胆固醇甲酰基乙基二胺(B) [15]。此外，1 和对甲苯磺酰氯(TsCl) 反应生成四乙二醇单对甲苯磺酸酯( 2)，再和叠氮钠反应生成相应的O-(2- 叠氮基乙基) 三乙二醇(3)。3和丙烯酸乙酯经加成反应得4,7,10,13- 四氧杂-15-叠氮十五酸乙酯(4)，经催化氢化还原得4,7,10,13-四氧杂-15- 氨基十五酸乙酯(5)。5 再和二碳酸二叔丁酯反应得15-( 叔丁氧羰基) 氨基-4,7,10,13- 四氧杂十五酸乙酯(6)，经氢氧化锂水解得15-( 叔丁氧羰基) 氨基-4,7,10,13- 四氧杂十五酸(7)。7 和B再经酸胺缩合反应得N-[4,7,10,13- 四氧杂-15-( 叔丁氧羰基) 氨基十五烷酰基]-N’-( 胆固醇甲酰基)-乙二胺(8)。8 经三氟乙酸脱保护得N-(4,7,10,13-四氧杂-15- 氨基十五烷酰基)-N’-( 胆固醇甲酰基)-乙二胺(9)。9 再和C 缩合得N2-[N15- 叔丁氧羰基氨氧基乙酰基-(4,7,10,13- 四氧杂-15- 氨基十五

烷酰基) ] -N1-( 胆固醇甲酰基) 乙二胺(10)，最后脱去氨基保护基即得N2-N15- 氨氧基乙酰基-(4,7,10,13- 四氧杂-15- 氨基十五烷酰基)]-N1-( 胆固醇甲酰基) 乙二胺盐酸盐(APCL 盐酸盐)，总收率4.7％ ( 合成路线见图2)。本路线中的化合物4、5、6、10 及APCL 盐酸盐均为未见文献报道的新化合物。

2.2 细胞毒性试验[18]

用MTT 比色法检测APCL 盐酸盐和CA 盐酸盐在人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人肺癌细胞(A549)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7) 和人乳腺癌细胞(MCF-7) 中的细胞毒性。以空白组为阴性对照，检测结果见表1。

2.3 阳离子脂质体的制备

运用薄膜分散- 超声法将DOTAP、DOPE 分别和氨氧基脂质(APCL 或CA 的盐酸盐) 按摩尔比DOTAP ∶ DOPE ∶ APCL 盐酸盐( 或CA 盐酸盐)(50 ∶ 40 ∶ 10) 的处方量制备成脂质体储备液，并使脂质体在缓冲液中的总浓度为2 mg/ml。由于氨氧基脂质本身不具有运载基因的作用，在配置脂质体时，其占比控制在10％为最佳，具体制备方法如下：

按照上述处方量取各脂质溶剂于玻璃圆底烧瓶中，旋转减压蒸干溶剂，使脂质在烧瓶底部形成完整的薄膜。用氮气继续吹干脂质体薄膜，加一定量的4- 羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPEs，pH 7)，水合20 ～ 30 min 使薄膜脱落下来。在100 KHz 功率的超声下使脂质体颗粒均匀分散在缓冲液中形成脂质体储备液。将APCL 盐酸盐参与的脂质体处方记为P1(DOTAP ∶ DOPE ∶ APCL 盐酸盐=50 ∶ 40 ∶ 10)，CA 盐酸盐参与的处方记为P2(DOTAP ∶ DOPE ∶ CA 盐酸盐=50 ∶ 40 ∶ 10)。检测2 种脂质体的粒径、ζ 和PDI，检测结果见表2。

2.4 阳离子脂质体-DNA 复合物的制备及体外转染试验

2.4.1 阳离子脂质体-DNA 复合物的制备

取上述2 种脂质体储备液各200 ml，按照DOTAP 和质粒的摩尔比(N/P) 为4 ∶ 1 计，取适量的质粒pDNA( 这里用的是荧光素酶报道基因Luciferas 以便于检测试验结果)。用HEPEs 把质粒稀释至200 ml。在涡旋下将质粒缓慢加入到脂质体溶液中，并在37 ℃水浴中孵育1 h 即可形成脂质体-DNA 复合物。之后检测此复合物溶液的粒径、ζ 值和PDI。检测结果见表3。

2.4.2 体外转染试验

以HepG2 细胞株为靶标，进行体外转染试验。除P1、P2 两个处方组外，另设一组不加样的空白对照组。每组设置3 个平行样，共3×3 个孔。提前一天将细胞铺于96 孔板，每孔1 ～ 2 万个细胞。培养一天后，将培养基吸出，用PBS 200 μl 洗涤3 次。计算每孔所需的DNA 用量( 按照DOTAP 和质粒的摩尔比为4 ∶ 1 计算)，用不含血清的DMEM 培养基稀释至300 μl，加入三组样，每孔100 μl，空白样中只加培养基100 μl。在37 ℃、5％ CO2 条件下转染4 h 后，将液体吸出，加入完全培养基200 μl继续培养一天。将培养基全部吸出，用PBS 洗涤96 孔板3 次，每孔加入1 ∶ 5 稀释的细胞裂解液30 μl，放入-20 ℃冰箱中冻0.5 ～ 1 h 至液体全部冻结。取出化冻10 min，取出孔中液体20 μl 至流式细胞管中，加入荧光素酶底物20 μl，混合均匀并迅速放至吸光度仪中，测量相对吸光度值(RLU)，结果见图3。由图可知P1 和P2 均有转染活性，但P1 的活性比P2 高出5 倍左右。

2.5 阳离子脂质体-DNA-PEG 复合物的制备及体外转染试验

为了进一步验证APCL 和CA 分别参与的阳离子脂质体通过耦合反应连接上PEG2000(CHO)2 后的体外转染效率，本研究制备了阳离子脂质体-DNAPEG复合物，并对其进行转染试验。

取上述P1、P2 脂质体储备液各200 μl，用0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液调至pH 4，并加入各处方中氨氧基脂质0.5 倍摩尔量的PEG2000(CHO)2，反应24 h 后用0.1 mol/L 的盐酸调回pH 7，即得阳离子脂质体-DNA-PEG 复合物，分别记为处方P1’、P2’。取P1’、P2′ 照“2.4.2”中所述方法操作，结果见图4。由图可见，P1′ 和P2′ 也均有转染活性，但P1′ 的活性仍比P2′ 好，在3 倍以上。

为消除不同传代批次的细胞对转染试验产生的差异化结果，取处方P1、P2、P1′ 和P2′ 脂质体储备液各200 μl，以同一代数的细胞为靶标，在其他条件都相同的情况下检测4 种处方的转染效率，结果见图5。和空白对照相比，P1 和P2，P1′ 和P2′ 组均有一定的转染能力，且P1 和P1′ 组比P2 和P2′ 组有着更显著的转染能力。

3 小结

在阳离子脂质体中加入氨氧基辅助脂质APCL后处方P1 的各项参数值表明，APCL 可以和阳离子脂质及其他辅助脂质形成阳离子脂质体，且能顺利包裹DNA，形成脂质体-DNA 运载体复合物。在相同条件下，处方P1( 含10％ APCL 盐酸盐) 同处方P2( 含10％ CA 盐酸盐) 相比，体外转染效率要高出5 倍左右，证明APCL 和CA 虽同为辅助脂质，但对于阳离子脂质体体系的性能却相差很大。原因可能在于APCL 的结构中含有PEG175 连接链，导致水溶性比CA 好，能更好的包裹DNA 物质；其次APCL 的链长比CA 更长，在脂质体中的舒展性更好。而DOTAP 和DOPE 均为链长较长的脂质，在以它们为处方制成的脂质体制剂中加入结构更相近的脂质分子能更好地适应体系，发挥脂质体的功能。

本研究还对阳离子脂质体耦合连接PEG 后的处方，即脂质体-DNA-PEG 复合物进行体外转染效率检测。结果显示，APCL 参与的处方P1′ 同CA参与的处方P2′ 相比，也有着更好的体外转染活性，在3 倍左右。该结果表明，耦联上PEG 聚合物后，APCL 仍然比CA 更适配于阳离子脂质体体系。原因可能在于APCL 和PEG 耦联后形成的分子相较于CA 和PEG 耦联后形成的分子在细胞中更易被水解，能更快释放出包裹的基因物质。

本研究检测的相同转染条件下的4 种处方的体外转染数据显示，连接PEG 聚合物后的处方P1′ 和P2′ 跟连接之前的P1 和P2 相比，转染效果总体差异不明显，表明连接PEG 后的脂质体不会影响对DNA 的运载效率。

上述试验结果显示，APCL 作为一种新的氨氧基辅助脂质有着很好的运用前景，未来APCL 或许可替代CA 参与到阳离子脂质体中完成siRNA 的运载，以提高阳离子脂质体对基因物质的运载效率。

4 化学合成

N- 胆固醇甲酰基乙基二胺(B)

四乙二醇单对甲苯磺酸酯(2)

O-(2- 叠氮基乙基) 三乙二醇(3)

4,7,10,13- 四氧杂-15- 叠氮十五酸乙酯(4)

4,7,10,13- 四氧杂-15- 氨基十五酸乙酯(5)

15-( 叔丁氧羰基) 氨基-4,7,10,13- 四氧杂十五酸乙酯(6)

15-( 叔丁氧羰基) 氨基-4,7,10,13- 四氧杂十五酸(7)

N-[4,7,10,13- 四氧杂-15-( 叔丁氧羰基) 氨基十五烷酰基]-N’-( 胆固醇甲酰基) 乙二胺(8)

N-(4,7,10,13- 四氧杂-15- 氨基十五烷酰基)-N’-( 胆固醇甲酰基) 乙二胺(9)

N2-[N15- 叔丁氧羰基氨氧基乙酰基-(4,7,10,13-四氧杂-15- 氨基十五烷酰基)]-N1-( 胆固醇甲酰基) 乙二胺(10)

N2-[N15- 氨氧基乙酰基-(4,7,10,13- 四氧杂-15-氨基十五烷酰基)]-N1-( 胆固醇甲酰基) 乙二胺盐酸盐(APCL 盐酸盐)

Design, Synthesis and Transfection Efficiency of Aminooxy Lipids

张秋晨，姜发琴，谢东升，杨凤志，傅磊*

(上海交通大学药学院，上海 200240)

致谢：感谢徐宇虹教授实验室( 上海交通大学)对本研究生物实验方面的支持。

基金项目：上海交通大学医学与工程学院跨学科研究基金(YG2015QN03、YG2014MS10和YG2017MS77)、国家自然科学基金(81202397)、上海自然科学基金(12ZR1415400)

作者简介：张秋晨(1993—)，女，硕士研究生，专业方向：药物化学。