从事合成工艺研发首先需要的三点意识:
1.平行反应.
这点适合在工艺研发初期使用.因为最初阶段,主要是对反应条件的优化,其中包括试剂当量,温度,浓度,反应时间等等变量,基于每次只改变一次变量的原则,所需反应数将是庞大的,尤其是在所要考察的变量较多的情况下.此时平行反应的概念就显得尤为重要,它可以大大提高条件优化的效率,使你在短时间内得到最优条件.
2.stress test.也就是破坏性试验。
这是在工艺初步完成优化之后,对工艺适用范围的一次检验.因为在实验室和在工厂中每一个单位操作所需时间都是有差异的,所以在去工厂放大之前,要在实验室中模拟工厂的放大条件.找到一个稳定工艺的范围而不是一个点.这样才能安全的去工厂生产.
3.spiking experiment.也就是强化实验.
这是在上述两项都完成之后,对工艺性能的验证,例如spec设定是否合理,杂质是否能够除去等等.
在具备了这三点意识之后,就是微观的具体工艺如何优化的问题了.工艺研发的不同阶段,决定了工艺研发的目标不同.从研发早期到研发晚期,目标依次为:
1. 提高反应效率
2.提高产品收率和质量
3.减少成本
4.提高规模化生产力
5.减少废物排放
在工艺研发之前,一定要明白自己研发工艺的目标,从而让自己的所有和工艺研发相关的活动紧紧围绕研发目标而设计,提高自己的工作效率.而为了明晰自己的研发目标,则需要对现有工艺有一个深刻的理解和判断,这些理解和判断由提问开始:
- 工艺开发的阶段是什么?早期以交货为主,晚期以工艺研发为主.
- 时间有多少?根据时间的长短,来安排工艺研发活动的优先级.
- 现有工艺有哪些缺陷?路线是否合适?收率怎样?是否涉及到毒性试剂或者毒性物质?后处理是否方便?成本怎样?等等.主要是找出工艺中主要存在的问题,根据优先级,逐条列出来.
在理解了上面这些问题之后,自己就有了一个清晰明确的目标,对原工艺也有了一个深刻的认识,接下来就是根据具体问题来设计具体的实验来解决这些问题.
这里需要重点强调一下实验设计的重要性.
很多人都强调高效的工作方式,但这种高效来自于做事的目的性.如果做事目的性强,每一个行动都能针对特定的问题,而没有重复和返工,这就是高效.所以在实验之前,一定要想清楚自己这个实验是要验证什么,从而在其中有针对性的设计操作来实现自己的假设.比如最近在做的一个反应,生成之前,需要转化率的spec,但平时在实验室反应都是100%转化,那能不能设100%呢?当然不能,所以自己这个实验的目的就是验证转化率在什么范围内,自己的工艺过程能够接受.反应结束后,PSC发现转化率100%,于是自己向反应体系中加入一定量的原料,HPLC监测显示是4%,也就是现在转化率是96%,然后按原工艺进行后续操作,拿到终产品后,发现纯度和之前一样,并通过对中间过程的监测发现,多于的原料在中间的后处理过程已经被除掉,所以这个实验可以定义为转化率为96%时,该工艺可以接受.
在有了理性的实验设计之后,就是对工艺的具体研发和优化.这里涉及到更多的是经验部分,需要的是耐心的观察和积累.多做,多看,多想,多积累.这部分因人而异,并且自己也只有两年的工艺经验,就不在这里卖弄了.在日后过些时日,再把自己的经验与大家分享。
工艺研发过程中数据量是巨大的,如果不定期对这些数据进行分析整理的话,就相当于这些反应都白做了.有些人觉得整理数据很麻烦,宁愿多做实验.但麻烦归麻烦,整理还是要需要的.只有对数据做了整理,才能从数据分析中看出目前工艺研发的效果怎样, 问题在哪,后续还需要做哪些实验来填补.而在众多需要收集的数据中,有两类数据尤其重要:
一、HPLC Assay,
HPLC Assay 是做工艺研发中非常重要的一个数据,可以说是必备工具之一.它可以很方便的从固体,液体中得到产品含量.而前提是要有对应产品的标准物质(纯度要求比较高,HPLC纯度最好>98%,研发初期阶段可以通过柱层析得到少量标准物质).将其配置成一定浓度的标准溶液就可以用了(具体的计算方法请参考网络上zhangfei的PPT).通过HPLC Assay,可以方便的监测反应液,萃取液,水相,过滤母液,湿滤饼等中产品的含量,为后续研发可以提供如下指导:
- 产品分布.监测反应液的Assay yield,萃取时每次萃取液的产品分布,水相的产品分布,过滤时母液的产品分布,反应收率等等.通过这一整套数据分析,可以清晰的看到所用工艺的效果以及后续如何改进.
- 质量守恒.通过检测反应液的Assay yield,然后对比分离收率,找出差值,然后分析样品损失在哪个阶段,核对数据是否吻合.如果不吻合,则提示产品有可能在某一个过程分解了.
二,qNMR.
qNMR可以揭示出产品的实际含量.常规的HPLC分析只能监测出带有紫外吸收的杂质,而对于那些没有紫外吸收的杂质,例如无机盐,重金属以及硅胶之类的物质是监测不出来的.而对于这些杂质,却可以通过定量核磁来分析.如果产品的HPLC纯度和qNMR纯度数据一致,说明产品质量没问题,而如果这两个数据不一致的话,则预示着这个产品有问题.下面我举三个例子来说明这个qNMR监测的重要性:
- 我曾经遇到过一个问题,HPLC纯度(210 nm)98%,而qNMR显示只有85%.做了几批都是如此.经过深入研究分析发现,我得到的不是羧酸,而是它的钠盐.随后将分子量按钠盐修订后重新计算qNMR,得到的实际含量是98%,两个数据吻合.
- 另外一个例子也是HPLC纯度98%,而qNMR只有90%.反复思考不知道是何原因.后来发现所得产品是HPF6盐(反应中用到了HATU),通过做磷谱验证了我们的推测.随后经过重新换算,其qNMR也是98%.
- 最后一个例子是产品HPLC纯度很高,接近100%,随后做重结晶时,却总是无法重复早已开发好的结晶工艺.百思不得其解.后来把产品做qNMR,发现只有70%左右,重金属监测发现有大量的Al残留,正是残留的Al导致了结晶不成功.
三,溶解度数据.
化合物的溶解度是工艺研发中一个非常重要的数据.有了化合物的溶解度,我们可以设计化合物的萃取体系,打浆体系,结晶体系以及清洗工艺.所以溶解度的测定对于工艺开发者来说是一项非常重要的技能.
通常溶解度的测定有两种方法:平衡法和动态法.
平衡法:是将被测物在恒温下搅拌,静置后分析上层清液的组成作为该温度下的溶解度.
动态法分两种:一种是在一定量溶质和一定量溶剂的条件下,逐渐改变体系的温度使溶质完全溶解;另一种是溶剂的量一定,在一定温度下,逐渐增加溶剂里溶质的含量至平衡.
在实验室条件下,我们推荐用平衡法来测,具体方法是:称取已达到过饱和溶液的上清液配成一定浓度的溶液,通过HPLC Assay的方法,得到所取溶液中所含溶质的量,然后换算成其对应的溶解度.
通常拿到一个项目时,不一定对每个中间体都做溶解度的测定,但对于关键中间体,对于那些被设定为quality control point的中间体,推荐去做较为全面的溶解度测定.因为通常对于这样的点,我们要设计一定的纯化方法来控制它的质量,对应的我们需要知道它在什么溶剂中溶解好,什么溶剂中溶解度差,进而为我们设计更为合理的打浆或者结晶体系提供数据支持.
工艺研发中产品质量是我们要达到的第一目标.如果产品质量不合格,工艺其他方面做的再好,都是徒劳.说到产品质量,就离不开杂质研究.尤其是越到后期阶段,杂质研究就越深入.
说到杂质,可以分为一下几类:
- 基因毒性杂质(Genotoxic impurity).有些物质是已知的基因毒性杂质,例如:甲磺酸酯类,卤代烃类,磷化物类等等.有些物质则要通过实验进行验证.对于有基因毒性alert基团(硝基,氨基,卤代基团,重氮等等)的化合物,可以先进行in silico的评估,对于有潜在基因毒性的化合物,再进行实验验证.如果实验结果为阳性,则证明该化合物为基因毒性化合物,反之,则归于常规杂质.对于基因毒性杂质,ICH要求对其进行严格控制,具体的限定标准要根据dose量,试验周期等来计算,通常要求ppm级.
- 重金属残留物.工艺中我们经常要用到含金属的试剂,例如Pd催化剂,Cu催化剂,Al催化剂等等.尤其是Pd和Cu催化的cross coupling反应在现在工艺路线中经常被用到,所以它们的残留,也是工艺研发中经常会遇到的问题.
- 反应副产物(side product)以及降解产物(degradation product).这个就多讲了,主要涉及到的是由副反应以及产物不稳定降解产生的物质.
- carryover impurity.这部分杂质主要是由于原料没有完全参与反应,进而被带入产品中.或者是前几步的原料由于没有被完全消耗,被带入到下一步产物中,然后在相应的反应条件下,参与反应,进而被带入到下下不反应,或者一直如此下去,一直被带到API中.
杂质研究也有不同的研究阶段:
- 对于早期阶段,更多的关注点被放在了如何除去杂质,而不对杂质结构做过多的解析.
- 而如果项目进行到了晚期阶段,则要求对杂质做更深入研究:解析杂质,研究对应的除去方法,了解杂质在工艺中的行为以及工艺可以承受的杂质范围.
对于杂质研究的早期阶段,很重要的一个思维就是模块化.将每一步的整个工艺切换成若干个模块,然后分别研究每个模块的效果.这一模块化思维对于研究杂质尤其适用.下面举例说明一下.一步反应的工艺为:反应结束后,加水淬灭,有机溶剂提取产品,浓缩结晶,过滤,烘干.我们可以把这个工艺分为这几个模块:反应,提取,浓缩,结晶,烘干.于是我们会对每个模块做样分析,通过数据收集,对比分析,我们就可以看出每个模块的杂质情况,除去情况,纯化情况,以及杂质的走向.进而根据这些数据开评估每个模块的效果,然后做相应的调整和优化.
而对于杂质研究的后期阶段,只做以上这些就不够了.首先我们要对主要的杂质进行结构解析,这就要求我们对反应机理有比较深刻的认识和理解,推测可能的副反应和副产物,能够分离的,分离出来做图谱解析,不能够分离的可以做MS验证.这是整个阶段中最难的一部分.有了上面的知识,我们就可以根据它的结构性质,设计相应的应对策略,跟踪它在工艺中的行为.同时做相应的spiking实验来检测工艺对于它的承受范围.
因为杂质在产品中的含量很少,对于它的分离难度会很大.我们有几个途径来实现它:
- 如果根据该反应机理,我们推测出了它的结构,我们可以通过其他合成途径来合成它.
- 如果我们无法推测它的结构,只能通过把它分离出来,做图谱解析来确定结构,我们就需要找到办法富集它:要么通过强化反应条件,增加它的含量,要么通过收集母液富集它。
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