非血红素铁(II)/α-酮戊二酸（α-KG）依赖性加氧酶是一类通过形成自由基中间体催化一系列级联转化的酶家族，实现对反应途径的控制是非常有价值的，也是拓宽这类生物催化剂应用的必要步骤。目前，已经使用了许多方法来设计Fe(II)/α-KG依赖酶的反应途径，包括定点突变、DNA改组和位点饱和突变等。

图片来源：J. Am. Chem. Soc.

最近，University of Michigan, Ann Arbor的Alison R. H. Narayan课题组展示了一种新的祖先序列重建（ASR）指导策略，使用进化信息来精确定位对控制不同反应途径至关重要的残基。

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随后，使用组合定点突变方法快速评估了每个残基的重要性。

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这些结果通过DNA改组策略和量子力学/分子力学（QM/MM）模拟进行了验证。使用这种方法，确定了一组活性位点残基以及底物和活性位点残基之间的关键氢键，这对决定主导反应途径至关重要。

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最终，这项工作成功地将进行苄基羟基化的现存和祖先酶转化为可以催化氧化扩环反应的突变体，展示了利用ASR策略加速具有共同结构和机制特征的酶家族反应途径工程的潜力。

原文标题：Engineering the Reaction Pathway of a Non-heme Iron Oxygenase Using Ancestral Sequence Reconstruction

原文作者：Di Yang, Chang-Hwa Chiang, Taveechai Wititsuwannakul, Charles L. Brooks III, Paul M. Zimmerman, and Alison R. H. Narayan*

https://doi.org/10.1021/jacs.4c08420